Гели, используемые в методе ГПХ сефадекс

Гель-хроматография. В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, щироко используют метод молекулярных сит, или гель-хроматографию. При обработке эпихлоргидрином полисахарида дек-страна образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нерастворимых в воде и называемых сефадексами. Благодаря большому сродству к воде зерна сильно набухают в водной среде с образованием геля, которым заполняют хроматографическую колонку. Разделение веществ этим методом основано на том, что большие молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу геля, являющуюся стационарной, и остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки небольшие молекулы, напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновесную систему между подвижной и стационарной фазами, и соответственно с меньшей скоростью двигаются вдоль колонки (рис. 1.5). Обычно момент появления веществ в вытекающем из колонки с сефадексом элюенте выражают формулой [c.30]

Центральной задачей при получении олигосахаридов почти из любого источника является выделение индивидуальных соединений из смеси моно- и олигосахаридов. Для этой цели разработано несколько методов, основанных на хроматографии . Наиболее старым из них является распределительная хроматография на целлюлозе . Для элюирования обычно используют системы растворителей, аналогичные тем, которые применяются для бумажной хроматографии сахаров (см, гл, 14), Этот метод позволяет осуществлять вполне удовлетворительное разделение, однако характеризуется малой емкостью колонок и требует довольно много времени. Более эффективна адсорбционная хроматография на смеси угля и целита (см., например, " ). С таких колонок моносахариды обычно элюируются водой, а олигосахариды элюируются в порядке возрастания степени полимеризации водно-спиртовыми смесями с увеличивающейся концентрацией спирта. В последние годы такой метод стал основным способом разделения смесей олигосахаридов. Смеси высших олигосахаридов хорошо разделяются гель-фильтрацией на сефадексе Г-25 . Однако для низших олигосахаридов (степень полимеризации 2—4) этот способ мало эффективен . [c.425]

На стр. 193 мы уже говорили о том, что с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-25 можно очистить и выделить конъюгированные эстрогены из мочи беременных женщин [121]. (Этот метод используется для ранней диагностики беременности [122, 123].) Позже было предложено предварительно отщеплять (с помощью ферментов) кислый углеводный компонент (хотя при этом утрачивался эффект концентрирования). При очень низкой концентрации гормонов повышение концентрации пигментов после этой стадии [c.227]

При исследовании биологических макромолекул эти методы широко применяются в препаративных и реже аналитических целях. Гранулированный материал, используемый для электрофореза, обычно представляет собой сухой порошок, связывающий на своей поверхности различные количества воды. К наиболее употребительным относятся порошки из стекла и пластмассы (поливинилхлорида или чаще сополимера поливинилхлорида и поли винилацетата), гранулированный крахмал и целлюлозный порошок. Можйо также использовать суспензии гидратированных частичек геля, таких, как сефадекс или агароза, приготовленные в виде колонок или блоков. [c.46]

С помощью гель-фильтрации на сефадексе, агаре или агарозе из раствора вируса удаляют примеси небольших молекул. Экстракт наслаивается иа вершину колонки гранулированного геля, уравновешенного соответствующей средой. Частицы вируса, не проникая внутрь гранул геля, будут двигаться через колонку быстрее, чем низкомолекулярные вещества, которые могут проникать в гранулы. Гель-фильтрацию обычно используют ка последнем этапе очистки вируса. Этот метод удобен также для некоторых вирусов, которые должны быть быстро удалены из первичного осветленного экстракта, так как обеспечивает замену растворителя, в котором находится вирус. Колонка с сефадексом 0-100 диаметром 5 см и длиной 50 ом обладает достаточной емкостью для нанесения 200 мл осветленного экстракта [1671]. [c.43]

Для бобовых многие авторы предпочитают использовать ионообменную хроматографию (DEAE — целлюлоза, DEAE — сефадекс и др.) гель-фильтрации. Этот метод в целом обеспечивает достаточное разрешение и использовался для фракционирования белков сои [20,60, 116], гороха [40,47] и люпина [34]. [c.154]

Проводить на самой мелкой фракции, однако этот метод редко используют для препаративных целей. Фракционирование в препаративных масштабах рекомендуется вести на тонких фракциях сефадекса (20—80 мкм) или био-геля (40—75 мкМ). [c.398]

Наряду с сефадексом для гельфильтрации успешно применяются другие материалы, такие как агар и синтетические гидрофильные полимеры, например, полиакриламидные гели — биогели, а также гидрофобные полимеры, набухающие в органических растворителях и используемые для фракционирования гидрофобных полимеров. Весьма удачным для белковой физико-химии оказалось использование агара. Пористость агарового геля зависит от концентрации агара. С уменьшением его концентрации в геле доступность внутренних частей зерен для макромолекул увеличивается. На низкоконцентрированных гелях (2,5—5%) имеется возможность разделять белки с молекулярным весом вплоть до миллионов [25]. Так, гемоцианины, тироглобулин, у-глобу-лин человека, сывороточный альбумин, а- и р-лактоглобулин обладают существенно различными скоростями перемещения на колонке из агара. Стандартизация метода гельфильтрации позволяет его использовать не только для фракционирования белков, но и для определения молекулярного веса в весьма простом хроматографическом эксперименте. Интересной областью приложения гельфильтрации на сефадексе явилось определение молекулярного веса мономерных форм белков, способных к ассоциации. Как известно, полная диссоциация подобных комплексов наблюдается при столь низких концентрациях растворов, когда использование [c.204]

Для разделения, выделения, очистки и идентификации различных полимерных соединений весьма удобным является метод гель-хроматографии. Он уже нашел широкое применение в биохимии и химии высокомолекулярных соединений [1—7]. В качестве гелей обычно используют продукты сшивания дек-странов (гели Сефадекс ) [8, 9], агарозы (гели Сефароза ) [10], а также сополимеры акриламида (Био-гели Р) [11—14]. Такие гели обычно применяют в интервале значений pH 2- -11 [c.67]

Для разделения и концентрирования ферментных белков часто используют метод гель-фильтрации с применением сефадексов—полимерных цепей полисахарида декстрана, соединенных через определенные промежутки поперечными связями и образующих своеобразные молекулярные сита, способные разделять белки в соответствии с их молекулярной массой [48, 49]. [c.170]

Гель-фильтрацию на сефадексе сразу же после появления этого метода стали использовать для выделения пептидных гормонов из гипофиза. На фиг. 25 был приведен классический пример — выделение окситоцина и вазопрессина из задней доли гипофиза с помощью комплексообразования [29]. По-видимому, для разложения белковых ассоциатов совсем не обязательно применять 70%-ную муравьиную кислоту для этих целей, очевидно, вполне достаточна 0,1 М кислота [30, 31]. Лизин-вазопрессин образует димер, который может быть отделен от высших полимеров хроматографией на сефадексе 0-25 (2,2x200 см) в 1 М уксусной кислоте [32]. При обработке окситоцина 80%-ным ацетоном получают новый неактивный продукт (вероятно, изопропилиденовое производное), который можно очистить распределительной хроматографией на сефадексе 0-25 в одной из систем растворителей, указ [й-ных для окситоцина в табл. 29 [33]. Окситоциназа околоплодных вод отщепляет от гормона по меньшей [c.215]

Например, Виллокс с сотр. [32] в исследованиях метаболизма анилина у пауков хроматографировал водорастворимые метаболиты на сефадексе G-15, проводя элюирование водой. В этом случае, при отборе фракций по 15 мл, жидкостный сцинтилляционный счет показал наличие двух основных метаболитов. Гель-хроматография часто используется для анализа высокомолекулярных комплексов. Игл [33] анализировал экстракты, содержащие индолуксусную кислоту, связанную с белком из растений, на колонках с сефадексом G-25 или G-50. Элюат собирали по фракциям объемом около 2 мл и для измерения активности отбирали пробы по 0,2 мл. Нельсон с сотр. [34] использовал сефадекс G-10 для разделения продуктов, которые образовались при инкубировании микросом печени в присутствии [ С] ацетилгид-)азина. Они собирали фракции по 2 мл. Клейн с сотр. 35] хроматографировал на сефадексах G-I00 и G-200 55]гепаран-сульфат и также использовал метод со сбором фракций. Гель-хроматографию применяют и для разделения полисахаридов. Пример разделения меченых В-глюканов приведен в работе Говарда с сотр. [36]. [c.193]

Для опытов использовался хлористый аммоний особой чистоты А-Г, растворы готовились на свежеперегнанном тридистилляте. Исследование проведено с кристаллическим бычьим сывороточным альбумином фирмы Ko h-Light Laboratories, Ltd. и отчасти с кристаллическим препаратом альдолазы, выделенным из мышц кролика по методу, описанному в работе [6]. Гомогенность белковых препаратов проверялась с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-100 и электрофореза в полиакриламидном геле. [c.229]

Dowex 1 в ее l - или НСОО -форме. Фракцию фосфатов очищали от элюента, содержащего соли, гель-фильтрацией на сефадексе G-10. Разделение на бумаге проводили для кислотонеустойчивой фракции, выделенной после нескольких циклов ионного обмена. В ходе разделения применяли систему растворителей, предложенную Хансом и Ищервудом [151] для разделения эфиров фосфорной кислоты. Разделение осуществляли в течение 48 ч нисходящим методом системой н-пропанол — аммиачная вода — вода (6 3 1), Три соединения были проявлены путем опрыскивания реагентом, состоявшим из растворов хлорного железа и салицилсульфокислоты [132]. Было установлено, что одно из соединений является кислотонеустойчивым фосфатом. Величина Rpp (расстояние, пройденное зоной, к расстоянию, пройденному зоной пирофосфата) указывала на то, что это соединение должно быть дифосфатом, возможно пирофосфатом. Два других вещества — неидентифици-руемый фосфат и не содержащий фосфора комплексообразующий агент, возможно, оксалат аммония. Оксалат аммония удаляли из исходного раствора вымораживанием и раствор разделяли, используя тот же элюент в течение 5 дней. Фракцию кислотонеустойчивого фосфата экстрагировали из бумаги и разделяли повторно смесью изопропиловый эфир — 90%-ная муравьиная кислота (3 2) нисходящим методом в течение 8 ч. Была получена зона, соответствующая пирофосфату. [c.339]

Гель-хроматография на сефадексе LH-20 в системе хлороформ— метанол — гексан оказалась особенно эффективным методом выделения каротиноидов из их смеси со стероидами [365, 366]. Для отделения каротинов от растительных белков и от других пигментов можно использовать ионообменную хроматографию на DEAE-целлюлозе в 0,5 М растворе хлорида натрия [367]. В работе [368] описан модифицированный вариант обычного метода анализа каротинов и ксантофиллов, предусматривающий периодическое обновление смеси силикагеля 60 и хайфлосуперцела [368]. Время разделения на новой колонке составляет 30 мин, причем ее можно использовать четырежды. [c.249]

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭЛЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и др. [c.97]

Разновидностью метода фракционирования на колонке является гель-хроматография [86]. В качестве разделительного вещества применяют органические или неорганические вещества (например, силикагель) пористой структуры с размером пор, зависящим от плотности сшивок и условий получения. Для фракционирования полимеров, растворимых в воде, чаще всего применяют набухший в воде декстран с различной степенью сшивания (сефадекс). Для растворов полимеров в органических растворителях применяют сшитые полистиролы или сополимеры метилметакрилата с этилен-гликольдиметакрилатом. Образец полимера растворяют, заливают в колонку и элюируют, используя тот же самый растворитель. Небольшие молекулы полимера свободно диффундируют внутрь геля. Размеры некоторых молекул оказываются настолько большими, что им не удается проникнуть внутрь пор, в результате чего они первыми выходят из колонки при элюировании. Продолжительность элюирования фракций возрастает с уменьшением размера макромолекул. Существует критическое значение молекулярной массы, ниже которого макромолекулы полимера могут проникать в поры сетки и поэтому могут быть разделены. Молекулы большего размера уже не могут быть разделены, так как они не могут диффундировать в гель. Частота сетки геля и критическое значение молекулярной массы связаны между собой простой зависимостью чем чаще сетка, тем меньше критическое значение молекулярной массы. [c.83]

Комбинированное использование тонкослойной гель-фильтрации с электрофорезом или иммунодиффузией до настоящего времени представляет собой один из наиболее тонких методов микроанализа белков. Хансон и др. [10] разработали метод двумерного разделения, используемый для анализа белков. На первом этапе белки подвергают гель-фильтрации в тонком слое сефадекса G-200 или G-100, а на втором — электрофорезу. Они предложили прибор, в котором хроматографическую пластинку можно закреплять под углом для гель-фильтрации и горизонтально для электрофореза. В описанных экспериментах использовали стеклянные пластинки размером 30 x 30 см и толщиной 1 мм, на которые наносили слой геля сефадекса толщиной 0,5 мм. Для набухания сефадекс оставляли в 0,05 М вероналовом буферном растворе pH 8,6. Сначала проводили гель-фильтрацию, а затем в направлении, перпендикулярном первому, в течение 3 ч вели электрофорез при градиенте напряжения 10 В/см. Этот метод весьма успешно был применен для анализа сывороток крови человека, спинномозговой жидкости и гормона роста. [c.240]

Сефадексы используют в качестве молекулярных сит при жидкостной хро-) матографии методом гель-фильтрации (синонимы гель-хроматография, гель-проникающая хроматография, молекулярно-исключакщая хроматография, экс-клюзиониая хроматография). Вещества с размерами молекул больше, чем размер пор геля, проходят через колонки с сефадексами без проникновения внутрь частиц геля, и элюируемый объем равен свободному, т. е. не занятому частицами геля объему колонки (обычно 38—42%). Мо/.екулы размером меньше, чем размер пор геля, будут проходить через зерна геля по этим порам, и в результате увеличения сечения колонки, проницаемого для таких молекул, их движение по колонке будет более медленным (элюируемый объем таких веществ будет больше свободного объема колонки). Другими словами, скорость движения отдельных веществ в колонках связана с коэффициентами распределения этих веществ между гелем и данным элюирующим раствором, чем больше коэффициент распределения, тем медленнее элюирование и тем больше величина элюируемого объема. [c.161]

Разделение на фильтрах из геля сефадекса позволяет использовать различие в молекулярном весе [21, 24, 126, 127]. Этот метод по своей эффективности приблизительно соответствует диализу, но может быть осуществлен гораздо быстрее. Линднер и др. [128] экстрагировали сухой препарат задней доли гипофиза свиньи (активность окситоцина и вазопрессина 2—3 Е /мг) пиридиноацетагным буфером. После нейтралит зации раствор пропускали через колонку с сефадексом G-25, элюировали этим же буфером и получили две фракции, дающие положительную реакцию с нингидрином. Первая, более подвижная фракция содержит окситоцин и вазопрессин в виде комплексов пептид — белок вторую фракцию, состоящую из низкомолекулярных неактивных соединений, отбрасывали. Десятиминутная обработка первой фракции 1 М муравьиной кислотой при 70 приводит к диссоциации комплекса и при повторном пропускании через сефадекс G-25 и элюировании 1 М муравьиной кислотой получили медленно передвигающуюся фракцию вазопрессина и окситоцина с активностью приблизительно 100 Е мг. [c.409]

Избирательность различных материалов, используемых для гель-фильтрации, позволила использовать их в других методах разделения. Так, гели сефадексов применяются в адсорбционных методах, тонкослойной и распределительной хроматографии, а также в качестве носителя при зонном электрофорезе. Сефадексы с ионообменными свойствами (диэтил-, аминоэтил-, карбоксиметил-, сульфоэтнлпроизводные декстранового полимера) обладают одновременно преимуществами ионообменных смол и материалов на основе целлюлозы. [c.478]

При разделении защищенных нуклеозидов, например ано-мерных рибофуранозилпроизводных урацила, в качестве сорбента с успехом используют нейтральную окись алюминия, а в качестве элюента — смеси бензола и этилацетата в разных пропорциях [44, 45, 84, 85]. В табл. 37.6 приведены значения Ка основных нуклеозидов на колонке с сефадексом на основании этих данных можно оценить возможность разделения той или иной смеси методом гель-проникающей хроматографии при использовании элюентов различного состава [47, 48, 67—69]. Хорошие результаты дает разделение на обычных или специально фракционированных биогеле Р-2 [86, 87] и сефадексе 0-10 [88]. Показано, что эти два геля можно использовать для определения нуклеотидного состава нуклеиновых кислот (рис. 37.11). Биогель Р-2 применяют также для разделения нуклеозидов в присутствии большего количества нуклеотидов, которые в этом случае элюируются существенно быстрее, чем на сефадексе 0-10. Хроматографию на биогеле Р-2 или сефадексе 0-10 неоднократно использовали в качестве микроаналитического метода при определении нуклеозидного состава энзиматических гидролизатов ДНК [89—91] и идентификации концевых нуклеотидов [92]. Смесь рибо- и дезоксирибонуклеозидов разделяли на колонке с фракционированным биогелем Р-2 в буферном растворе (pH 10,1), содержащем тетраборат натрия (рис. 37.12) [87]. Для отделения тимидина от 5-бром- и 5-иоддезоксиуридинов предложено проводить хроматографию на сефадексе 0-10 в фос-фатноцитратном буферном растворе с pH 3,5 [93, 94]. [c.53]

Гель-хроматографию особенно целесообразно применять в тех случаях, когда необходимо очень быстро отделить высокомолекулярные компоненты от низкомолекулярных. На специально подготовленной колонке (3X6 сл) с сефадексом 0-25 (грубым) Эрлан-деру [25] удалось всего за 2 мин полностью отделить рибонуклеазу от воды, содержащей тритий. Этот быстрый аналитический метод позволяет изучить кинетику обмена трития и на этом основании сделать выводы о степени спирализации растворенного белка. Несколько позднее аналогичная методика была успешно использована при исследовании вторичной структуры растворимых рибонуклеиновых кислот [26] и дезоксирибонуклеиновых кислот [27]. Конечно, нуклеиновые кислоты также могут быть модифицированы химическим путем, например действием диазотированной сульфаниловой кислоты [28]. Избыток реагента и побочные продукты реакции удаляют на сефадексе 0-50. [c.146]

По сравнению с сильно набухающими сефадексами и полиакриламидными гелями агарозы обладают большей жесткостью и выдерживают более высокие давления. Уступая полиакриламидным гелям по разделительной способности, они в целом дают лучшие результаты, так как этот недостаток агароз можно компенсировать применением длинных колонок (за счет лучших фильтрационных свойств). Так как разные фирмы используют различные методы для выделения агарозы (отделения агаропектина от агара), продукты могут иметь различную чистоту и молекулярную массу. Эго отражается и на хроматографических характеристиках гранулированных агароз — их прочности, адсорбционной способности и т. п. В большинстве случаев гели производят в бисерной форме, но выпускают также гранульные гели с зернами произвольной формы. Поставляют гели в гидратированном состоянии, с раствором, содержащим антисептики, обычно — 0,02% азида натрия и 0,001 М ЭДТА (окончание на стр. 62). [c.57]

Области применения полиакриламидных гелей те же, что и сефадексов (см. разд. 28). Для обессоливания наиболее пригодны гели марок от Р-2 до Р-10. Гель Р-2 успешно применяют для обессоливания пептидов и нуклеотидов. Сорбционные свойства полиакриламидов используют при разделении основных белков, нуклеотидов, нуклеозидов и нуклеиновых оснований методом адсорбцион ной хроматографии (В о п i 11 аС. А., Anal. Bio hem., 1969, v. 32, No. 3, p. 522— 529). [c.63]

В то время как обычный электрофорез белков в тонком слое сефадекса, по-видимому, не представляет особого интереса, сочетание тонкослойной гель-фильтрации с последующим электрофорезом существенно расширяет возможности метода, поскольку наряду с более высоким разрешением здесь удается провести электрофоретическую идентификацию разделяемых компонентов. Методика двумерного фракционирования белков была разработана Иоханссоном и Римо [49] и подробно изложена в работе Хансона и сотр. [14]. Согласно этой методике, первой стадией разделения является гель-фильтрация в слое сефадекса (0-200 или 0-100) толщиной 0,5 мм на пластинках размером 30-30 см. Затем в перпендикулярном направлении в течение 3—4 ч ведут электрофорез при градиенте напряжения 10 В/см. В качестве электролита используют 0,05 М вероналовый буфер с pH 8,6. При электрофорезе пластинку необходимо охлаждать. Относительно простой и удобный прибор показан на рис. 5. [c.269]

Гель-проникающая хроматография [39] является разновидностью метода фракционирования на колонке, в которой разделение на фракции осуществляется по методу молекулярного сита, основанному на способности молекул проникать в поры адсорбента определенного размера. В качестве адсорбентов в данном методе используют материалы, не имеющие зарядов и ионогенных групп, обладающие точно заданным размером пор (см. гл. 18). Наилучшим образом этим требованиям удовлетворяют специально приготовленные сополимеры стирола с дивинилбензолом, которые при набухании образуют гели. Отсюда и название метода. Кроме того, применяют гели декстрана (сефадекс), разновидности силикагелей (сферосил) и др. [c.296]

Хроматографические материалы для гель-хроматографии, их назначение и структура подробно описаны в гл. 6. При соответствующей степени грануляции и применении надлежащей методики их также можно использовать для приготовления тонких слоев. Полная информация о декстрановых гелях марки сефадекс суперфайн , поставляемых фирмой Pharma ia, содержится в выпущенной этой фирмой рекламной брошюре [2]. Выбранный гель оставляют набухать в жидкой среде в течение рекомендованного промежутка времени, после чего суспензию геля наносят в виде слоев толщиной 0,5 мм с помощью соответствующего приспособления. Чтобы в системе установилось равновесие, пластинки с нанесенным слоем помещают в специальную камеру (рис. 9.6). В разд. 9.2.2 кратко изложен метод приведения системы в равновесие. В работе [66] описано разделение пуриновых и пиримидиновых оснований и нуклеотидов по упрощенной методике на смеси 16 г сефадекса G-10 с 4 г силикагеля GF254 или 4 г целлюлозы. Приготовленный слой сохраняет разделяющие свойства сефадекса, но прочность его повышается, становится примерно такой же, как у слоев силикагеля или целлюлозы. [c.109]

В полной мере этот эффект начали использовать после 1959 г., когда Порат и Флодин, [44] опубликовали работу, посвященную разделению соединений на гелях сшитого декстрана, и описали быстрый и простой метод фракционирования водорастворимых веществ (этим утверждением начиналась их статья). Они назвали предложенный метод гель-фильтрацией. В то же время фирма РЬагтас1а (Упсала, Швеция) наладила выпуск сефадекса — сшитого декстрана. И это, по-видимому, и явилось основной причиной быстрого развития и широкого распространения метода, который вскоре был освоен и начал применяться почти во всех отраслях биохимии. В настоящее время, когда со дня первой публикации прошло более 20 лет, [c.339]

Смотреть страницы где упоминается термин Гели, используемые в методе ГПХ сефадекс: [c.11] [c.219] [c.512] [c.109] [c.258] [c.120] [c.254] [c.201] [c.273] [c.567] [c.49] [c.136] [c.277] [c.21] [c.83] [c.222] [c.226] [c.232] [c.422] [c.110] [c.80]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология