Рестрикционная карта

Построение рестрикционной карты [c.45]

Рис. 3.3. Рестрикционная карта ДНК представляет собой линейную последовательность сайтов расщепления, находящихся на определенном расстоянии друг от друга.

При построении рестрикционных карт обычно используют несколько рестриктаз, поэтому приходится анализировать сложные соотношения между фрагментами, полученными под действием различных ферментов. Процедуру картирования можно значительно упростить с помощью специальных приемов. [c.45]

Построение рестрикционной карты вируса. ДНК, выделенная из вируса, инфицирующего животные клетки, имеет обычное эквивалентное соотношение оснований и устойчива ко всем известным экзонуклеазам. [c.993]

Рис. 4.4. Картирование сайтов рестрикции. А. Результаты гель-электрофореза фрагментов ДНК, полученных ее расщеплением указанными ферментами. Очищенную ДНК гидролизовали рестриктазами ЕсоК и ВатШ раздельно, а затем их смесью, проводили гель-электрофорез и визуализировали продукты окращива-нием бромистым этидием. Числа слева от горизонтальных полос -длина фрагментов в парах оснований. Б. Рестрикционная карта, построенная по электрофоретическим данным. Числа - расстояние между сайтами узнавания соответствующих ферментов.

Сравнение размеров фрагментов ДНК после обработки соответствующего участка генома набором рестриктаз позволяет построить рестрикционную карту, отражающую расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке. Сравнением таких карт можно оценить степень гомологии между отдельными генами (участками) без определения их нуклеотидной последовательности. Рестрикционные карты важны для клонирования ДНК, решения эволюционных и филогенетических задач. [c.108]

Комбинируя методы концевой метки и неполного расщепления, можно определить расположение всех фрагментов, полученных под действием одной рестриктазы. Сочетая этот метод с методом перекрывающихся фрагментов, а также используя несколько рестриктаз, можно быть уверенным, что построенная рестрикционная карта включает всю ДНК и ни один из мелких фрагментов не потерян. [c.46]

РЕСТРИКЦИОННЫХ КАРТ (ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ) [c.27]

Затем следует построить карту ДНК. Для этого ДНК разрывают в определенных точках, расстояние между которыми можно точно измерить. Такие точные разрывы возможны благодаря рестриктирующим ферментам (ферменты рестрикции, рестриктазы), мишенью которых служат короткие специфические последовательности ДНК. Карта ДНК, полученная в результате локализации точек разрыва, называется рестрикционной картой. Она представляет собой линейную последовательность сайтов, в которых определенные рестриктирующие ферменты специфически узнают свои мишени. Расстояние между сайтами рестрикции измеряют прямо в нуклеотидных парах ДНК (сокращенно п. н. для коротких отрезков и т. (п.) н. тысяча (пар) нуклеотидов для длинных отрезков). [c.43]

Пример использования этого метода показан на рис. 3.1. Индивидуальную молекулу ДНК длиной 5000 п. п. обрабатывают отдельно двумя рестриктаза-ми-А и В. Разрезанные фрагменты ДНК разделяют с помощью электрофореза. Можно видеть, что фермент А разрезал ДНК-субстрат на четыре фрагмента размером 2100, 1400, 1000 и 500 п. н., тогда как фермент В образовал три фрагмента размером 2500, 1300 и 1200 п. н. Можно ли на основании этих данных расположить сайты рестрикции в определенном порядке и построить рестрикционную карту [c.44]

Все данные, полученные при сравнении специфического действия рестриктаз А и В, сведены в рестрикционную карту на рис. 3.3. Таким образом, молекула ДНК размером в 5000 п. н. поделена на серии участков определенной длины, расположенные между участками, специфически узнаваемыми двумя рестриктирующими ферментами. [c.45]

Рис. 1.2, Генетическая и рестрикционная карта ДНК вируса 8У40 (цифрами указано положение сайтов рестрикции)

Следует иметь в виду, что при реконструкции больших фрагментов из маленьких всегда получается хорошее совпадение размеров (в пределах разрешающей способности метода). Характерной чертой рестрикционных карт является их полная аддитивность по длине. [c.45]

Генетическая и рестрикционная карты характеризуют один и тот же материал с разных точек зрения. Однако, сопоставив карты обоих типов, можно установить физическую основу генетической карты. Кроме того, результаты рестрикционного расщепления можно объединить с генетической картой. [c.46]

Рестрикционная карта представляет собой серию сайтов линейно расположенных в ДНК, расстояние между которыми соответствует реальному расстоянию вдоль нуклеиновой кислоты. Рестрикционную карту можно получить для любой последовательности ДНК, независимо от того, идентифицированы ли на ней мутации и известно ли что-нибудь о ее функции. [c.46]

Чтобы сопоставить рестрикционную и генетическую карты, нужно сравнить рестрикционные карты ДНК дикого типа и соответствующих мутантов. Связь между генетической и физической картами можно установить на основе одного рестрикционного картирования, если имеются мутанты, сильно изменяющие генетическую карту. Например, маленькая делеция или вставка, нарушающая генетическую карту, вызовет соответственно уменьшение или увеличение размера того рестрикционного фрагмента, в котором она находится. Более протяженная делеция (или вставка) может удалять (или вводить) серии рестрикционных сайтов. Такой пример разобран на рис. 3.4. [c.46]

Точковые мутации труднее локализовать на рестрикционной карте. Иногда они могут изменить сайты-мишени для рестриктирующего фермента. В противном же случае их не удастся определить, так как размеры рестрикционных фрагментов ДНК дикого типа и мутантов оказываются одинаковыми. Поэтому для локализации таких замен оснований часто необходимо определить последовательность оснований в ДНК. [c.46]

Существование полиморфизма в геноме можно установить, сравнивая рестрикционные карты разных индивидуумов. Критерием полиморфизма в этом случае служит изменение в характере расположения фрагментов, образованных в результате расщепления рестриктирующим ферментом. На рис. 3.5 показано, что если в геноме одного индивидуума имеется сайт-мишень для рестриктирующего фермента, отсутствующий у другого, то в результате дополнительного расщепления в первом геноме образуется два фрагмента, соответствующих в совокупности одному целому фрагменту во втором геноме. [c.47]

Поскольку рестрикционная карта не зависит от функции гена, полиморфизм на этом уровне можно обнаружить независимо от того, приводит ли изменение нуклеотидной последовательности к изменению фенотипа или нет. В действительности только незначительная часть случаев рестрикционного полиморфизма в геноме, по-видимому, проявляется в виде фенотипических изменений. Возможно, что в большинстве случаев имеет место такое изменение последовательности нуклеотидов, которое не [c.47]

Различие в рестрикционных картах двух индивидуумов можно использовать в качестве генетических маркеров точно так же, как и любые другие маркеры. Единственное отличие состоит в том, что вместо того, чтобы изучать некий фенотипический признак, исследуют непо- [c.47]

Если рестрикционные полиморфные сайты распределены в геноме случайно, некоторые из них окажутся около интересующего нас гена-мишени. Такие рестрикционные маркеры можно идентифицировать по их тесному сцеплению с мутантным фенотипом. Если мы сравним рестрикционные карты ДНК у больных и здоровых людей, то может оказаться, что у больных определенный рестрикционный сайт всегда присутствует (или всегда отсутствует). Гипотетический пример изображен на рис. 3.7. В этом случае сцепление рестрикционного маркера с фенотипом составляет 100%. Это означает, что рестрикционный маркер находится так близко от мутантного гена, что никогда не отделяется от него при рекомбинации. [c.48]

Мы можем прямо определить последовательность каждого из этих фрагментов, но, для того чтобы быть уверенным, что мы не потеряли мелких фрагментов, образованных в результате расщепления ферментом двух близко расположенных участков (проблема, обсуждавшаяся в предыдущем разделе), важно продолжить определение последовательности через места соединения фрагментов. Для этого нужен еще один набор фрагментов, в котором оставались бы интактными места соединения А—В. И так же, как можно построить рестрикционную карту перекрывающихся фрагментов, можно построить и общую последовательность ДНК, анализируя перекрывание отдельных последовательностей ДНК. [c.51]

Рестрикционная карта кластера тандемных генов обладает характерной особенностью. Она имеет вид кольца. Когда повторяющиеся единицы идентичны, расположение сайтов рестрикции в них совершенно одинаково. Соседние повторы имеют общие концевые фрагменты. В приведенном на рисунке примере фрагмент А находится по соседству с фрагментом В, соседствующим с фрагментом С, который в свою очередь находится рядом с фрагментом А таким образом и получается кольцевая карта. [c.289]

На рис. 37.6 представлена карта области, содержащей примерно 15 т.п. оснований, которая включает все известные сайты мутаций. Мутации классифицированы в соответствии с изменениями, которые они вносят в рестрикционную карту. Тип мутаций и их расположение соответствуют двум зонам с потенциально разными функциями. [c.477]

В локусе ш идентифицированы потенциальные точечные мутации, которые могут не вызывать изменений в рестрикционной карте. Генетическое картирование по- [c.477]

Чтобы построить рестрикционную карту, следует сравнить размеры фрагментов, полученных при раздельной рестрикции и при рестрикции смесью ферментов. Результат такого сравнения представлен на рис. 4.4,Б. Если при гидролизе ДНК каждой из двух рестриктаз ( соЯ1 и ВатШ) образуются три фрагмента, значит, в исходном фрагменте ДНК было два сайта узнавания для каждой из использованных рестриктаз. Фрагмент размером 300 п. п., который образуется в результате гидролиза соК1, не расщепляется [c.53]

Для секвенирования крупных фрагментов ДНК (примерно 2000 п. н.) используют другие стратегии. Одна из них состоит в следующем. Встраивают этот фрагмент в соответствующий плазмидный вектор и строят его подробную рестрикционную карту. Идентифицируют перекрывающиеся фрагменты вставки длиной от 100 до 500 п. н., субклонируют каждый из них в ДНК М13, секвенируют и воссоздают нуклеотидную последовательность всего исходного фрагмента. Чтобы быть уверенным в правильности полученного результата и идентификации какого-либо нуклеотида, необходимо секвенировать обе цепи по нескольку раз. Секвенирование обеих цепей облегчается тем, что каждый из субкло-нированных фрагментов исходной ДНК может быть встроен в ДНК М13 в противоположных [c.92]

Рис. 20.27. Прогулка по хромосоме . А. Зонд 1 гибридизуют с клонированным фрагментом ДНК длиной 40 т. п. н. После субклонирования и построения рестрикционной карты последовательность, дистальную по отношению к гибридизовавшейся, используют для создания зонда 2. Б. При помощи зонда 2 из библиотеки выбирают другой клон (отличный от клона 1) и используют последовательность, дистальную по отношению к гибридизовавшейся с ним, для создания зонда 3. Клоны 1 и 2 вместе составляют примерно 80 т. п. н. (за вычетом перекрывающегося участка - зонд

Рестрикционная карта (Restri tion шар) Диаграмма расположения на молекуле ДНК сайтов узнавания рестриктазами. [c.559]

После выявления рекомбинантных клонов, содержащих гены целлюлаз, проводят накопление рекомбинантной ДНК и составляют ее рестрикционную карту, идентифицируя положения различных сайтов рестрикции и путем делеционного анализа (получая дочерние плазмиды с вставками меньшг[ размера) уточняя положение и размер нужного гена [c.104]

Фрагменты ДНК условно обозначены прямоугольниками, верхняя сторона которых представляет собой одну комплементарную цепь, а нижняя сторона — другую. Слева указаны эндонуклеазы, использованные для получения перекрывающихся блоков. Вверху длна рестрикционная карта определяемого фрагмента. Стрелками в прямоугольниках указывается длина расшифрованного участка и направление, в котором определялась последовательность (в данном случае она определялась в направлении от 5 - к З -концу). [c.315]

Использование электрофореза для разделения рестрикционных фрагментов дает возможность получать рестрикционные карты — последовательности ДНК с нанесенными на них сайтами разрезания для различных рестриктаз. Первая карта была получена для вируса SV 40, содержащего 5423 пары оснований (рис. 1.2). Использовали рестриктазу Hind III, расщепляющую кольцевую ДНК вируса на 11 фрагментов. Порядок их расположения в ДНК был установлен путем исследований наборов обра- [c.28]

Располагая такой информацией, можно локализовать на ДНК биологически важные участки. Так, например, показано, что репликация вируса SV 40 всегда начинается в одном специфическом Hind Ш-фрагменте и продолжается в обоих направлениях. Рестрикционные карты и рестрикционные фрагменты были также использованы для картирования участков ДНК, на которых синтезируются мРНК для вирусных белков. [c.32]

Подробную рестрикционную карту можно связать с генетической картой. Крупные генетические изменения, такие, как делеции или вставки, можно обнаружить методом рестрикционного картирования. Они приведут к уменьшению или увеличению соответствующих рестрикционных фрагментов. Кроме того, иногда в разультате генетиче- [c.46]

При картировании с использованием нескольких рестриктаз могут быть получены результаты и того, и другого типа. Разрывы, вносимые одними ферментами, не попадают в промежуточную последовательность тогда длина соответствующих фрагментов увеличивается. При использовании других ферментов из той же промежуточной последовательности будут образовываться дополнительные фрагменты. Объединяя вместе эти данные, мы видим, что при создании полной рестрикционной карты гена, содержащего интроны, карта каждого конца гена соответствует карте каждого конца последовательности мРНК. Но в некоторой точке внутри гена карты различаются там имеется дополнительная область, содержащая ряд сайтов узнавания, отсутствующих в мРНК. Разрешающая способность метода рестрикционного картирования позволяет обнаруживать участки гена размером до 20-30 п. н. [c.249]

На рис. 20.10 приведено сравнение рестрикционных карт р-глобинового гена и глобиновой мРНК. При этом обнаруживаются два интрона. Интрон большего размера совпадает с интроном, обнаруженным с помощью электронной микроскопии и показанным на рис. 20.5. Меньший интрон присутствует только на рестрикционной карте. [c.249]

Рис. 23.1. Кластер тандемно повторяющихся генов может состоять из чередующихся единиц транскрибирующихся и нетран-скрибирующихся спейсеров. Его рестрикционная карта имеет кольцевое строение.

Мутации, картирующиеся справа от (включая этот сайт), почти всегда отличаются нестрогим (leaky) эффектом и обусловливают остаточную пигментацию. В этой области не найдено потенциально точечных мутаций все мутации ведут к изменениям в рестрикционной карте. Подавляющее большинство мутаций представляют собой внедрения известных или предполагаемых подвижных элементов. (Атипичным аллелем является исходный м> тант с фенотипом белые глаза ). Эти мутации и определяют правый сегмент, простирающийся от до w. [c.479]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология