Белки избирательное расщепление

С-Концы пептидных цепей определяются избирательным отщепле нием концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 53), то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, надмуравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов, которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. [c.376]

Весь сложный процесс переваривания пищевых белков в пищеварительном тракте настроен таким образом, чтобы путем последовательного действия протеолитических ферментов лишить белки пищи видовой и тканевой специфичности и придать продуктам распада способность всасываться в кровь через стенку кишечника. Примерно 95—97% белков пищи всасывается в виде свободных аминокислот. Следовательно, ферментный аппарат пищеварительного тракта осуществляет поэтапное, строго избирательное расщепление пептидных связей белковой молекулы вплоть до конечных продуктов гидролиза белков —свободных аминокислот. Гидролиз заключается в разрыве пептидных связей —СО—МН— белковой молекулы. [c.418]

Значение белков в живой природе трудно переоценить. Это строительный материал живых организмов, биокатализаторы - ферменты, обеспечивающие протекание реакций в клетках, и энзимы, стимулирующие определенные биохимические реакции, т. е. обеспечивающие избирательность биокатализа. Наши мышцы, волосы, кожа состоят из волокнистых белков. Белок крови, входящий в состав гемоглобина, способствует усвоению кислорода воздуха, другой белок - инсулин - ответственен за расщепление сахара в организме и, следовательно, за его обеспечение энергией. Молекулярная масса белков колеблется в широких пределах. Так, инсулин - первый из бел- [c.13]

Большинство химических реакций, протекающих в пищеварительной системе, в крови и в клетках человека и животных, является каталитическими реакциями. Они ускоряются ферментами. Все ферменты — белковые вещества. Так, слюна содержит фермент птиалин, который катализирует превращение крахмала в сахар. Расщепление белков в желудке катализируется ферментом пепсином. Ферменты — исключительно активные катализаторы их действие отличается высокой избирательностью. [c.142]

Как указывалось раньше, при расщеплении белков на меньшие фрагменты с помощью протеолитических ферментов наблюдается значительно большая избирательность расщепления пептидных [c.397]

Избирательное расщепление белка приводит к образованию характерного набора пептидных фрагментов [29] [c.219]

Заключительный этап работы при выяснении порядка следования аминокислотных остатков в белковой молекуле—воссоздание первичной структуры белка на основании данных о последовательности их расположения в пептидах, полученных при селективном гидролизе. Так как избирательное расщепление пептидных связей при исследовании первичной структуры белков ведут не менее чем двумя агентами, обеспечивающими разрыв пептидных связей в разных точках полипептидной цепи, то первичные структуры того и другого набора полученных пептидов неизбежно перекрываются. Это открывает возможность воссоздания первичной структуры белка (рис. 28). Если при посредстве секвенатора удалось выяснить чередование аминокислотных звеньев в фрагментах белковой молекулы значительного размера, то это существенно упрощает процесс воссоздания ее первичной структуры. [c.59]

Процедура состояла в следующем конец бумаги, ближайший к разделяемым пептидам, помещали в смесь органических растворителей и воды, налитую на дно герметично закрывающейся стеклянной банки. При этом растворитель поднимался вверх по бумаге. В такой ситуации каждый пептид мог либо мигрировать с растворителем (неполярная среда), либо оставаться на обводненной целлюлозе бумаги (высокополярная среда). Такой метод разделения называется распределительной хроматографией. Пептид с наиболее выраженными неполярными свойствами будет растворяться в растворителе и, следовательно, подниматься вместе с фронтом растворителя вверх по бумаге в то же время самый полярный из пептидов останется на бумаге внизу. Рассматриваемые методы-хроматография на бумаге и электрофорез-дополняют друг друга, поскольку они разделяют пептиды на основе независимых свойств первый-на основе различий в полярности, второй-на основе различий в общем заряде. Вся последовательность проведения анализа - избирательное расщепление белка на небольшие пептиды с их последующим разделением в двух направлениях-называется методом пептидных карт (отпечатков пальцев). [c.93]

Из широко известных протеиназ следует прежде всего упомянуть пепсин, входящий в состав желудочного сока и способствующий перевариванию в желудке поступающих с пищей белков. В кишечнике млекопитающих дальнейшее расщепление белков осуществляется другой протеиназой — трипсином, выделяемым поджелудочной железой. В некоторых растениях, например, в млечном соке плодов дынного дерева, встречается еще одна протеиназа — папаин, способный расщеплять многие растительные белки. Все эти протеиназы расщепляют только амидные связи белков, но важно отметить, что действуют они избирательно на различные по своей природе амидные связи и весьма чувствительны к тем химическим группировкам, которые находятся по соседству с амидными связями. В частности, существуют даже особые протеиназы и пептидазы (так называемые аминопептидазы и карбоксипептидазы), которые расщепляют лишь амидные группировки, находящиеся на конце полипептидной или бел- [c.35]

Методы, принятые для определения последовательности аминокислот в белках, широко используют ферментативную деструкцию и последующее изучение осколочных полипептидных цепей небольшого размера и перекрывающегося строения, выделяемых и характеризуемых после проведения процесса деструкции. Тем не менее сохраняется необходимость в разработке избирательных и количественных химических методов расщепления основной цепи макромолекул белков. В последние годы было найдено несколько химических методов расщепления пептидных связей но остаткам метионина, триптофана, гистидина и тирозина. Многие из этих методов очень специфичны, причем расщепление протекает в таких местах молекулы белка, которые недоступны действию ферментов. Эти химические методы могут найти применение для специфического расщепления одной, двух или трех пептидных связей молекулы белка — соседних с аминокислотными остатками, встречающимися в молекуле один, два или три раза соответственно. [c.387]

В результате ферментативного воздействия, определяли последовательно после каждого отщепления Ы-концевого остатка по методу Эдмана (см. гл. 6). При изучении гемоглобина (Брауницер был удачно применен последовательный гидролиз белка разными про-теолитическими ферментами. В этом случае на белок действовали трипсином, а затем полученные пептиды гидролизовали пепсином, специфичность которого значительно повышали, ограничивая время реакции. Методические трудности, связанные с фракционированием сложных гидролизатов и определением полной структурной формулы белка, были преодолены в результате упорного труда нескольких групп ученых. Мы теперь знаем полную аминокислотную последовательность инсулина, глюкагона, рибонуклеазы, гемоглобина, белка вируса табачной мозаики, а также кортикотропина и других пептидных гормонов приближаются к завершению работы по установлению строения папаина, лизоцима, химотрипсиногена, трипсииогена, цитохрома с успешно продвигается изучение некоторых других белков. Изучение последовательности аминокислот проводилось на частичных кислотных гидролизатах или на гидролизатах, полученных при действии различных протеолитических ферментов. Чисто химические методы избирательного расщепления пептидных цепей не имели до сих пор значительного успеха, и эта область остается еще нерешенной задачей пептидно химии. [c.117]

Недавно Виткоп [231] и Томпсон [204] опубликовали обзоры, посвященные современному состоянию исследований по избирательному расщеплению и модификации белков. Для более детального ознакомления с историей вопроса, а также с проводимыми в настоящее время и проектируемыми исследованиями в данной области читатель отсылается к этим статьям. В табл. У1-29, взятой из обзора Виткопа, приведены принципы [c.387]

Виткоп в упоминавшемся выше обзоре приводит ряд критериев, существенных для успешного осуществления избирательного расщепления пептидов, пригодного к использованию на чувствительных к химическим воздействиям белках (ферментах и т. п.) без протекания каких-либо конкурирующих побочных процессов или денатурации. таким критериям относятся следующие 1) реагент должен обладать высокой избирательностью 2) реакция должна протекать быстро 3) присоединение реагента к реакционному центру должно приводить к образованию чрезвычайно] неустойчивого промежуточного продукта 4) требование неустойчивости промежуточного продукта обусловлено необходимостью осуществления быстрой одновременно протекающей 1,5-внутримолекуляр-ной реакции замещения у единственной пептидной группы, а именно у С-пептидной группы 5) образующийся иминолактон должен немедленно распадаться на фрагмент лактона С-концевого остатка и давать концевую группу — NH2 6) вся последовательность реакций должна быстро протекать в водных буферных растворах при нейтральных или слабо кислых значениях pH и комнатной температуре. [c.389]

Несомненно, что в ближайшее время появятся новые ценные реакции избирательного расш епления пептидных связей. В литературе уже опубликованы [204, 231] результаты, полученные при использовании описанных выше реагентов для избирательного расщепления белков с известной последовательностью аминокислот. В число этих белков входят белок вируса табачной мозаики, грамицидин А, рибонуклеаза, гемоглобин А человека, цитохром С, трипсин, трипсиноген и зимоген. [c.391]

Как правило, первичную структуру белка не удается установить путем последовательного секвенирования всей полипептидной цепи. Для этого приходится анализировать фрагменты, полученные избирательным расщеплением полипептидной цепи химическим или ферментативным методом. Следователыю, стадия фрагментации полипептидной цепи па низкомолекулярные пептиды с целью последующего структурного анализа — это один из важнейших этапов в определении ковалентно (первичной) структуры белка. [c.82]

Пептидная связь Asp-Pro особенно лабильна в условиях мягкого кислотного гидролиза 58, 73, 97, 108]. Избирательное расщепление может идти в кислой среде при гидролизе пепсином, при обработке белка раствором бромоциана в 70%-ной муравьиной кислоте или в процессе очистки пептидов гель-фильтрацией в водной уксусной или муравьиной кислоте. Частичный гидролиз связи Asp-Pro наблюдался, в частности, при обработке глутаматдегидрогеназы бромоцианом в 70%-ной муравьиной кислоте [140] в этой же работе обсуждается вероятный механизм кислотного гидролиза пептидной связи Asp-Pro. [c.93]

ХИМОТРИПСИН, фермент класса гидролаз, относится к эндопептидазам. Мол. масса бычьего X. 25 300, р1 9, оптим. каталитич. активность при pH 7,5—8,0, состоит из трех цепей, связанных дисульфидными мостиками. По типу каталитяч. центра относится к группе серин-гистидиновых гидролаз. Образуется в поджелудочной железе позвоночных из предшественника (химотрипсиногена) последоват. отщеплением двух дипептидов в середине цепи. Катализирует гидролиз белков, пептидов, эфиров и амидов аминокислот проявляет специфичность к гидрофобным аминокислотам, участвует в расщеплении белков пищи в тонком кишечнике. Ингибируется ионами тяжелых металлов, борорг. к-тами, диизопропилфторфосфатом и др. Избирательно гидролизует белки пораженных тканей. Использ. для лечения тромбозов, ожогов. [c.654]

Известны многочисленные работы по применению BNPS-скатола в химии белка [51]. Выход продуктов избирательного расщепления по триптофану составляет 40—80%. По-видимому, выход зависит от качества реагента. BNPS-скатол чувствителен к действию света, разлагается при комнатной температуре, темнеет и выделяет бром. В то же время высокоочищен- [c.108]

При отсутствии в молекуле белка остатков триптофана избирательное расщепление по тирозину можно проводить с помощью N-бpoмo yкцинимидa [33, 148, 165]. При наличии триптофана пептидные связи тирозина будут расщепляться только при большом избытке реагента. По всей вероятности, расщепление по тирозину идет по следующему механизму. [c.116]

В основе метода избирательного расщепления пептидной связи по аминогруппе остатков цистеина лежит превращение 5Н-групп в тиоциановые группировки [183]. Впервые о расщеплении пептидной связи цистинсодержащих белков под действием цианидов сообщалось в 1964—66 гг. [23, 24]. Образование остатков тиоцианоаланина (74), который циклизуется [c.118]

Специфическое расщепление по остаткам аспарагиновой кислоты. Метод модификации карбоксильных групп диаминами [112] позволяет проводить гидролиз белка избирательно по остаткам аспарагиновой кислоты. При этом происходит модификация С-концевой и карбоксильных групп глутаминовой кислоты. В связи с этим маловероятно, что метод найдет практическое применение для гидролиза белков. Однако метод вполне применим для гидролиза коротких пептидов, содержащих ограниченное количество или вообще не содержащих глутаминовой кислоты. [c.149]

Распределение белка и полисахарида или липополисахарида между фенолом и водой было применено для расщепления и разделения специфических осадков полисахаридных антигенов с антителами [40]. В принципе осадок диспергируют в воде и прибавляют при перемешивании равный объем жидкого фенола. После разделения фаз центрифугированием водный слой содержит свободный от антител полисахаридный антиген, который можно выделить и проанализировать. Метод позволяет очищать полисахаридные анти1 ены путем избирательного осаждения антителами [32, 40], т. е. фракционировать полисахаридные антигены по их серологической специфичности. Хоман и Лене 41] очистили препараты гепарина, содержащие белки, использовав смесь фенола с водой. Из водной фазы, которая оказалась свободной от белка, был выделен очищенный гепарин. [c.330]

Были проведены также многочисленные работы, ставившие целью найти такие условия расщепления белка, при которых пептидные связи распадались бы избирательно. В этом отношении самым многообещающим является ферментативный гидролиз. В распоряжении исследователей нмеется большой набор шротеолитичеоких ферментов, гидролизующих пептидные связи избирательно. [c.516]

Другие ферменты, например химотрипсин и пепсин (гл. 7, раздГ.2), менее избирательны, но все же их тоже можно использовать для расщепления пептидной цепи на фрагменты с последующим определением структуры этих фрагментов. Для установления полной аминокислотной последовательности белка нужно найти перекрывающиеся фрагменты, содержащие последовательности, в которые входят концы двух разных триптических фрагментов. Таким путем можно выстроить пептиды в том порядке, в котором они расположены в нативном белке. [c.167]

Оба модифицированных гена участвуют в процессе деградации всех субстратов данного метаболического пути. Поэтому стратегия, использованная для повышения эффективности расщепления 4-этилбензоата, применима и в случае других соединений мутация, приводящая к гиперпродукции Ху18-белка, может усиливать активацию Р -промотора и повышать скорость разрушения субстрата кроме того, можно избирательно модифицировать Р -промотор, чтобы он стал более сильным, сохранив способность взаимодействовать с Ху18-белком. Таким образом, проведенная работа показывает, что вполне реально усовершенствование того или иного катаболического [c.283]

Осуществленный таким способом гидролиз пептидньк связей-это необходимый шаг в определении аминокислотного состава белков и последовательности составляющих их аминокислотных остатков. Пептидные связи могут быть гидро-лизованы также под действием некоторых ферментов, таких, как трипсин и химотрипсин, представляющие собой протеолитические (белок-расщепляю-щие) ферменты, секретируемые в кишечник и способствующие перевариванию, т. е. гидролитическому расщеплению, белков, входящих в состав пищи. Если кипячение пептидов с кислотой или щелочью приводит к гидролизу всех пептидных связей независимо от природы и последовательности соединенных при их помощи аминокислотных звеньев, то трипсин и химотрипсин осуществляют каталитическое расщепление пептидов избирательным образом. Трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которьсс участвуют карбоксильные группы лизина или аргинина. Химотрипсин же атакует только те пептидные связи, которые были образованы с участием карбоксильных групп фенилаланина, триптофана и тирозина. Как мы увидим дальше, такой избирательный ферментативный гидролиз оказьшается очень полезным при анализе аминокислотных последовательностей белков и пептидов. [c.130]

Гидролазы. Ферменты этой группы играют особенно важную роль в пищеварении и в процессах пищевой технологии. К ним относится большая группа протеолитических ферментов, катализирующих гидролиз белков и пептидов. Большое значение в биохимии пищеварения принадлежит протеолитическим ферментам (пепсин, химиотрипсин, аминопептидаза, карбоксипептидаза и др.), осуществляющим деполимеризацию молекул белка по мере его движения по пищеварительному тракту. Протеолитиче-ские ферменты участвуют в процессах, происходящих при переработке мяса, в хлебопечении. С их помощью проводят умягчение мяса и кожи, их применяют при получении сыров. Действие протеаз очень избирательно. Одни протеазы разрушают пептидные связи внутри молекул белка — эндопептидазы и на конце ее молекулы (экзопептидазы), т. е. отщепляют аминокислоты с N- или С-конца, другие расщепляют пептидные связи только между отдельными аминокислотами. Так, трипсин разрушает пептидную связь между лизином (Лиз) или аргинином (Apr) и другими аминокислотами, пепсин — между аминокислотами с гидрофобными радикалами, например между валином (Вал) и лейцином (Лей). Фермент химотрипсин гидролизует пептидную связь между триптофаном, (см. схему) тирозином и другими аминокислотами. В самом общем виде схема расщепления пептидных связей в полипептидной цепи может быть представлена следующим образом [c.23]

Химические методы расщепления. Среди химических методов фрагментации белков наиболее специфичным и чаще всего применяемым является расщепление бромциаиом по остаткам метионина. Метод разработан в 1961 г. Э. Гроссом и Б. Виткопом и по избирательности действия не имеет себе равных. [c.48]

СЯ В цитоплазме клетки (рис. 2-14). Размеры их варьируют, но, как правило, не превьппают размеров митохондрий. Лизосомы содержат много различных ферментов, способных переваривать, т. е. расщеплять путем гидролиза, уже ненужные клеточные белки, полисахариды и липиды. Поскольку такие ферменты могут разрушить и остальное содфжи-мое клетки, они заключены в лизосомы. Белки и другие компоненты, которые необходимо разрушить, избирательно переносятся внутрь лизосом, где подвергаются гидролитическому расщеплению до простейших составных частей, поступающих затем обратно в цитоплазму. [c.40]

Восстановительное расщепление при действии боргидрида лития носит избирательный характер. В молекуле инсулина расщепление особенно активно протекает по одному из остатков глицина, В некоторых белках лабильны, по-видимому, пептидные связи, образованные остатками глутамина и аспарагина. В табл. 29 приведен перечень остатков дикарбоновых кислот, амидов дикарбоновых кислот и С-концевых остатков, присутствующих в немодифи-цированном белке вместе с перечнем соответствующих продуктов, присутствующих в гидролизате этерифицированного и восстановленного белка. В табл. 30 приведен анализ продуктов, полученных из [c.196]

Сульфиты. Хотя расщепление дисульфидных связей водными растворами сульфита — избирательный равновесный процесс, положение равновесия и скорость реакции сильно изменяются для разных дисульфидов [272, 273]. В результате этой реакции из каждой дисульфидной группы белка образуется одна меркаптогруппа и одна 3-сульфоцистеиновая группа [c.406]

В распоряжении исследователя имеется охарактеризованная кДНК, но ему требуются антитела, поскольку 1) нужный белок содержится в клетке в небольшом количестве или его трудно очистить, 2) либо необходимо получить антисыворотку, специфичную к определенному участку или субъединице данного белка. Последний подход обладает значительно большей избирательностью, чем скрининг группы моноклональных антител, и гораздо проще, чем выделение пептидных фрагментов путем ферментативного или химического расщепления. [c.142]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология