Саузерн-блоттинг

Рис. 36.9. Анализ родословных в случае серповидпоклеточной анемии. В верхней части рисунка (А) показано начало гена 6-глобина с сайтами расщепления рестриктазой Mst II (f) у нормального (А) и серповидноклеточного (S) В-глобина. В результате расщепления ДНК здоровых индивидуумов рестриктазой Mst II образуются специфические фрагменты ДНК размером 1,15 и 0.2 т.п.н. Замена одного основания у больных серповидноклеточной анемией приводит к потере одного из трех Mst 11-сайтов в области гена и соответственно к появлению только одного специфического Mst П-фрагмента размером 1,35 т. п. н. Это различие в длине легко обнаруживается методом Саузерн-блоттинга ( ). (На данном рисунке положение фрагмента длиной 0,2 т. п. н. не указано.) Анализ родословных демонстрирует три возможных генотипа. АА-норма (О), AS-гетерозигота по гену серповидноклеточности (ЭП) и SS-гомозигота по гену серповидных эритроцитов ( ). Этот подход позволяет осуществлять пренатальную диагностику заболевания серповидноклеточной анемией и выявлять гетерозиготных носителей соответствующего гена ( 4).

Рис. 4-72. Методы Нозерн - и Саузерн -блоттинга. После электрофоретического фракционирования смеси молекул ДНК или РНК в агарозном геле проводят перенос различных фрагментов нуклеиновых кислот на лист нитроцеллюлозы или найлона ( блоттинг ). Этот лист затем инкубируют с радиоактивным ДНК-зондом в течение длительного времени в условиях, способствующих гибридизации. Затем лист тщательно промывают, гак что радиоактивно меченными оказываются лищь те фрагменты, которые гибридизуются с ДНК-зондом. На радиоавтографе,

Методы Нозерн- и Саузерн-блоттинга позволяют гибридизовать молекулы нуклеиновых кислот, предварительно фракционированные с помощью электрофореза [44] [c.239]

Очень важной областью применения радиоавтографии является обнаружение радиоактивного ДНК-зонда после его гибридизации с препаратом ДНК, подвергнутым электрофоретическому разделению. К сожалению, провести гибридизацию в самом геле невозможно, поскольку зонд не может в него проникнуть. Поэтому ДНК после электрофореза переносят на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр по методу Саузерна (Саузерн-блоттинг) или с помощью элюции. Расположение молекул ДНК на фильтре в точности соответствует таковому в геле. Перенесенную на фильтр ДНК подвергают [c.65]

Перенос ДНК из геля на фильтр носит название Саузерн-блоттинга в честь Эдвина Саузерна, который изобрел этот метод. Использующиеся в литературе термины Нозерн-блоттинг и Вестерн-блоттинг относятся к переносу РНК и белков соответственно. Эти названия - в переводе северный и западный -не имеют никакого отношения к сторонам света и были придуманы остроумными коллегами Саузерна (Southern - южный). Тем самым они как бы напутствовали Саузерна на разработку новых методов переноса макромолекул, а также четко обозначили, о переносе каких макромолекул идет речь. Кроме того, все увидели, что шутить умеют не только физики, но и биологи. [c.65]

Рис. 25.32. Некоторые этапы анализа ДНК при генетическом скрининге. В процессе Саузерн-блоттинга денатурированная (одноцепочечная) ДНК переносится из агарозного геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр. В настоящее время бумажные полотенца обычно не употребляются вместо этого используют метод электро-блоттинга или вакуумного блоттинга.

Для визуализации специфического фрагмента ДНК или РНК среди тысяч других примесных молекул используется комбинация целого ряда экспериментальных приемов, которые в совокупности получили название блоттинг . На рис. 36.5 показаны схемы проведения Саузерн-блоттинга (для визуализации фрагментов ДНК), Нозерн-блоттинга (для РНК) и ] стерн-блоттинга (для белков). Первая процедура названа по имени автора методики, остальные возникли как лабораторный жаргон, но со вре- [c.43]

Рестриктаза. Эндонуклеаза, расщепляющая обе цепи ДНК в строго определенных сайтах со специфической последовательностью оснований. Саузерн-блоттинг. Метод переноса фрагментов ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр с последующей гибридизацией с меченым зондом. Сигнал. Конечный этап визуализации определенного фрагмента ДНК (клона). Например, при радиоавтографии—темное пятно на рентгеновской пленке, соответствующее месту нахождения гибридного дуплекса, одна из цепей которого является радиоактивно меченным зондом. [c.51]

Бринстер и др. инъецировали ген тимидинкиназы HSV под контролем промотора гена метал-лотионеина-1 и обнаружили, что у одной из полученных трансгенных мышей синтезировалось больше тимидинкиназы HSV в клетках печени и почек, чем у трех других, синтезировавших этот фермент лишь в небольшом количестве. Кроме того, восемь других трансгенных животных несли ген тимидинкиназы HSV, но не синтезировали активного фермента. По данным Саузерн-блоттинга, у всех трансгенпых мышей введенная ДНК присутствовала в большом числе копий. [c.428]

Цель данного этапа — выявить в каком из фрагментов находится интересующая нас последовательность ДНК. Это делают с помошью генного зонда. Поскольку зонд плохо продвигается в геле, используют метод, называемый Саузерн-блоттингом (Эдвард Саузерн разработал этот метод в 1975 г.). Последовательность операции представлена на рис. 25.32 (см. также раздел о генетической дактилоскопии, 25.7.12). [c.259]

Для анализа структуры гена альбумина дефектных мыщей был использован метод Саузерн-блоттинга. В данном случае вместо РНК анализируется ДНК Изолированную ДНК сначала обрабатывают рестрицирующими нуклеазами, затем полученные фрагменты разделяют по размеру гель-электрофорезом и выявляют комплементарные ДНК-зонду альбумина с помощью переноса и гибридизации, как это описано для РНК (см. рис. 4-72). Повторяя эту процедуру с различными рестрицирующими нуклеазами, можно получить детальную рестрикционную карту генома в участке альбуминового гена (см. разд. 4.6.2). Анализируя эту карту, можно ответить на вопрос, несет ли альбуминовый ген у дефектных животных перестройки, например, делеции или инсерции коротких фрагментов ДНК. [c.240]

Индуцируемые низкой температурой у пшеницы гены семейства W S120 были картированы с использованием вестерн- и Саузерн-блоттинга [c.26]

Блоттинг. Почти во всех случаях, подобных описанным выще, ДНК перед гибридизацией переносят с геля на более подходящую подложку. Этот метод (блоггшг) широко используется, например, для идентификации специфических РНК и белков после их электрофоретического разделения (см. разд. 7.7 и 6.4 соответственно). Блоттинг ДНК назван по имени его изобретателя блоттингом по Саузерну (или саузерн-блоттингом) соответствующие методики для РНК и белков получили название нозерн-блоттинга и вестерн-блоттинга. [c.278]

Молекулярная биотехнология принципы и применение (2002) -- [ c.65 , c.472 , c.473 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.240 ]

Биохимия человека Т.2 (1993) -- [ c.43 , c.44 , c.45 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.240 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология