Направленная эволюция белков

Подход, получивший название направленной эволюции белковых молекул, не требует досконального знания особенностей строения и функционирования создаваемых белковых молекул [5-7]. В основе этого экспериментального направления исследований лежат идеи, хорошо известные в эволюционной биологии. Для осуществления направленной эволюции белков в условиях лаборатории создают большие клонотеки случайных аминокислотных последовательностей, из которых вначале тем или иным [c.274]

Направленная эволюция белков [c.319]

Как следует из предшествующего изложения, для реализации концепции направленной эволюции белков требуется прежде всего иметь в распоряжении большой набор (выбор) макромолекул, среди которых можно было бы ожидать наличие белков с требуемыми свойствами. Если бы исходный пул макромолекул включал все возможные комбинации аминокислотных последовательностей, и желаемое свойство было бы присуще хотя бы одной из них, то получение нужного белка или фермента в требуе- [c.321]

Гены-репортеры в системе Y2H. Кроме приложений в стандартных исследованиях белок-белковых взаимодействий, система Y2H может быть эффективно использована в направленной эволюции белков для отбора мутантов, взаимодействующих с изучаемыми лигандами. В этом случае, удобство системы заключается в том, что интенсивность отбора эволюционирующих белков может быть регулируема. Так, на ранних этапах отбора, когда необходимо обнаруживать белки, обладающие небольшой активностью, используются высоко чувствительные системы генов-репортеров. Для выявления более активных мутантов следующего поколения силу отбора постепенно понижают, применяя менее селективные гены. [c.359]

Гораздо менее понятным феноменом являются ложноотрицательные результаты отбора в системе Y2H, которые проявляются в том, что взаимодействующие друг с другом белки не оказывают влияния на транскрипцию гена-репортера. Хотя такие артефакты не представляют серьезной проблемы в опытах по направленной эволюции белков, основной задачей которой является отбор белков, эволюционирующих к нужным свойствам, к такой возможности необходимо относиться очень серьезно при использовании разных систем Y2H в крупномасштабных исследованиях. Например, попытки воспроизвести результаты работы по изучению интер- [c.364]

Бактериальные дигибридные системы (В2Н). Одним из преимуществ системы В2Н перед Y2H при осуществлении отбора во время направленной эволюции белков является более высокая эффективность трансформации бактериальных клеток, что позволяет исследовать одновременно до 10 белков, а это на два порядка превышает возможности дрожжевой системы. Высокая скорость деления бактериальных клеток сокращает время проведения экспериментов, кроме того клетки Е. соИ являются эталоном в опытах по генной и белковой инженерии. В связи с этим системы В2Н становятся все более популярными в исследованиях белок-белковых взаимодействий. [c.365]

Получение ферментов с новыми свойствами путем объединения гомологичных белковых доменов. Случайное объединение участков полипептидных цепей двух близкородственных ферментов, методическое обеспечение которого рассматривалось выше, находит широкое применение в направленной эволюции белков. Однако такой подход порождает большое количество химерных молекул, полностью утративших биологическую активность, так как в ходе подобных манипуляций с большой вероятностью происходит нарушение тонких внутримолекулярных взаимодействий, обеспечивавших функциональность исходных белков. [c.378]

Экспрессия гибридных белков на поверхности бактериальных клеток. Еще одним интенсивно развивающимся направлением белковой инженерии, которое использует адресные домены и сигнальные последовательности, является экспонирование рекомбинантных белков на поверхности бактериальных клеток для создания бактериального дисплея, живых вакцин, а также иммобилизации самих клеток в процессе культивирования. Применение бактериального дисплея для направленной эволюции белков [c.379]

В целом, подходы рационального дизайна и направленной эволюции белков оказываются весьма плодотворными в преодолении пропасти между жесткими требованиями, предъявляемыми к промышленным ферментам, и их реальными биохимическими свойствами. Несомненно, активные исследования в этой области сделают нас в ближайшие годы свидетелями новых достижений. [c.402]

Вне зависимости от того, какая из двух обсуждавшихся выше концепций дизайна биотехнологических процессов будет преобладать в будущем, одним из основных вопросов белкой инженерии, по-видимому, останется вопрос о пределе совершенства идеального биокатализатора. Прежде всего необходимо выяснить, какие факторы лимитируют функции известной белковой молекулы, а поняв это потребуется найти способы преодоления таких ограничений. Рациональный дизайн белков развивается медленно из-за сложности объекта исследований. Пока не удалось даже установить основные закономерности, определяющие термостабильность белковых молекул для того, чтобы сознательно изменять это свойство в нужном направлении. В то же время методы направленной эволюции белков в последнее время быстро распространяются и находят все большее применение, поскольку по своей сути не требуют от исследователя предварительных знаний о структурно-функциональных отношениях в эволюционирующих макромолекулах. Прогресс в понимании структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах определит популярность рационального дизайна белков. А поскольку открытия в науке предсказать невозможно, делать прогнозы о ближайшем будущем развитии таких мощных направлений молекулярной биологии и генетики как генная и белковая инженерия - дело неблагодарное. [c.462]

Идеи С. Спигельмана оказались исключительно продуктивными для последующего развития молекулярной биологии и легли в основу одного из ключевых подходов к получению новых белков и ферментов с использованием методов направленной эволюции макромолекул. Однако, в отличие от обсуждавшихся выше классических опытов, разнообразие последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, эволюционирующие in vitro в такой системе, возникает не спонтанно, а создается исследователем с помощью случайного мутагенеза перед каждым новым раундом отбора белков с требуемыми свойствами. Поэтому эксперименты по направленной эволюции белков начинаются с формирования комбинаторных клонотек случайных последовательностей, которые охватывают определенную часть исследуемого пространства последовательностей. [c.321]

С помощью клонотек последовательностей, кодирующих Fab-фрагменты или s Fv-фрагменты антител, и всего арсенала методов направленной эволюции белков удается осуществлять продуктивный поиск каталитических антител требуемой специфичности (величины с последующим повышением эффективности [c.430]

На основе фагового дисплея разработан методический подход, названный направленной эволюцией белков. Последовательности ДНК выделенных в результате биопенинга пептидов или белков, аффинно связывающихся с целевой макромолекулой, подвергают мутагенезу и формируют вторичную фаговую библиотеку, которая содержит разные варианты отобранной на первом этапе последовательности. При анализе созданной вторичной библиотеки слитых фагов можно обнаружить вариант, который связывается с целевой макромолекулой с гораздо большей эффективностью. [c.200]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология