Геномное секвенирование

Одна из стратегий идентификации гена заболевания в отсутствие данных о продукте этого гена и каких-либо генов-кандидатов. В подобных случаях сначала определяют хромосомную локализацию (позицию) гена. Затем получают геномные клоны, охватывающие картированный сайт (используя соответствующие маркеры), идентифицируют и анализируют присутствующие в них экзоны. Используя целый ряд методов (идентификация G -островков, улавливание экзонов, секвенирование, компьютерный анализ и т.д.), определяют, какой именно ген ответствен за данное заболевание. [c.556]

Эти ДИ РНК, которые далее были проанализированы, имели ту же полярность, что и вирусные сегменты РНК, и в отличие от большинства ДИ РНК несегментированного минус-цепочечного вируса, вируса везикулярного стоматита, не имели комплементарных концов. Методами гибридизации, олигонуклеотидного картирования и секвенирования РНК 5 - и З -концов было показано, что все изученные до настоящего времени 16 ДИ РНК имеют природу гена полимеразы (РВ1, РВ2, РА) [21, 23, 24, 44] и несут оба 5 - и З -геномных конца [23, 51]. Олигонуклеотидное картирование показало, что различные по размеру ДИ РНК могут быть генерированы из одного гена полимеразы и что последовательности меньших ДИ РНК не всегда являются составляющими больших ДИ РНК. Поэтому было высказано предположение, что по крайней мере некоторые ДИ РНК образуются из внутренних делеций гена полимеразы с сохранением обоих концов [23], Однако эти эксперименты [c.251]

Большой размер эукариотических геномов обусловлен также наличием в них множества повторяющихся последовательностей ДНК с неизвестными функциями. На их долю приходится обычно 10%, а в некоторых случаях почти 50% генома. Более 15 лет назад при помощи кинетического анализа реассоциации денатурированной эукариотической ДНК было показано, что значительная часть ДНК ренатурирует гораздо быстрее, чем можно было бы ожидать для уникальных последовательностей ДНК. Высокая скорость реассоциации говорит о том, что такие геномы содержат фрагменты, повторяющиеся от сотен тысяч до миллионов раз. В настоящее время с помощью молекулярного клонирования и секвенирования подтверждено существование таких последовательностей ДНК с большим числом повторов, которые, подобно повторяющимся генам, могут располагаться либо тандемно, либо изолированно друг от друга среди неродственных геномных локусов. [c.13]

Рис. 3.8. Спаренная амплификация и секвенирование фрагмента геномной ДНК

Рис.8.22. Стратегия секвенирования участков ДНК, прилегающих к таковым, с уже известной последовательностью, геномной прогулкой с олиго-кассетой

Другую методику выявления ДНК на Саузерн-фильтрах разработали Черч и Гилберт [18] предложенный ими подход получил название геномного секвенирования. По сообщению авторов, метод позволяет детектировать 3 фг ДНК при 10-дневной экспозиции, что несомненно свидетельствует о достижении самой высокой на сегодня чувствительности метода. Подробные методики приводятся в отдельной работе [18]. В общих чертах этот метод состоит в использовании ДНК, пришитой с помощью ультрафиолетового облучения к найлоновым мембранным фильтрам, которую гибридизуют с высокорадиоактивной Р-меченной РНК в растворе, содержащем 1 % (весовая концентрация) БСА, 1 мМ ЭДТА, 0,5 М НаНРОд (pH 7,2) и 7% (весовая концентрация) додецилсульфата натрия (ДСН). Не ясно, какой именно фактор в данном случае обусловливает столь высокую чувствительность метода. [c.29]

Предложенный в 1984 г. метод геномного секвенирования был основан на выявлении определенных последовательностей ДНК путем их гибридизации с меченным зондом [ hur h, Gilbert, 1984]. Для осуществления такой гибридизации была необходима процедура переноса фрагментов ДНК из полиакриламидного секвенирующего геля на нейлоновый фильтр. Перенос даже небольших фрагментов ДНК из полиакриламидного геля на мембранные фильтры за счет капиллярных сил малоэффективен и поэтому в данной работе, учитывая большие размеры геля, была сконструирована специальная камера для электропереноса. [c.186]

Более удобными для генетических исследований и широкомасштабного секвенирования часто оказываются контиги из небольших фрагментов ДНК, чем из крупных. Для построения контигов определенных районов хромосом или целых хромосом нередко используют космидные библиотеки. Обычно перекрывающиеся космидные клоны идентифицируют методом геномной дактилоскопии. Для этого из каждого клона экстрагируют ДНК и обрабатывают ее рестриктазой. Полученные фрагменты метят, разделяют при помоши электрофореза и визуализируют радиоавтографическими методами. Каждый клон порождает специфический набор фрагментов - уникальный отпечаток его ДНК у перекрывающихся клонов один или несколько фрагментов совпадают. [c.463]

Internet Line). Они созданы исходя из некоторых характерных для экзона особенностей. Одна из них - ожидаемая нуклеотидная последовательность кодирующей области. Если лаборатория оснащена оборудованием для широкомасштабного секвенирования, можно секвенировать геномные клоны, охватывающие область расположения искомого гена, и провести компьютерную обработку полученных данных с целью выявления экзонов. Нуклеотидную последовательность предполагаемого экзона можно использовать для поиска гомологичных ей последовательностей в генной базе данных или синтезировать на ее основе олигонуклеотидный зонд для скрининга кДНК-библиотеки. Наконец, как и в случае других методов идентификации экзонов в геномных клонах, необходимо доказать, что предполагаемый экзон является частью гена-мишени. [c.476]

Наилучший способ определения структуры вирусной геномной РНК — анализ провирусной ДНК-формы генома, присутствующей в инфицированных клетках, например, с помощью блот-гибридизации клеточной ДНК [39]. На рис. 9.5 показан вариант такого анализа, демонстрирующий удаление интронов из гека, клонированного в ретровирусном векторе. Как правило, клеточную ДНК расщепляют рестриктирующими ферментами, которые узнают специфические сайты в пределах каждого из вирусных LTR, но не затрагивают внутренние последовательности так, в случае векторов семейства Mo-MLV для этой цели часто используют рестриктазы Xbal и 5ас1. Следует подчеркнуть, что в тех случаях, когда инфицированные клетки имеют мышиное происхождение, гибридизационная проба для блот-анализа не должна содержать MLV-последовательностей. В противном случае родственные MLV эндогенные провирусы ослож- нят интерпретацию картины гибридизации. При необходимости проводят детальное структурное картирование или секвенирование ДНК рекомбинантного провируса, используя клонированную провирусную ДНК. [c.299]

Если при амплификации геномной ДНК позвоночных в качестве праймеров для ПЦР используют олигонуклеотиды длиной 20 нуклеотидов и более, то процесс этот довольно специфичен и амплифицируется только один фрагмент ДНК- Однако иногда среди продуктов реакции наблюдается накопление фрагментов, происхождение которых трудно объяснить. А поскольку эти фрагменты могут мешать последующему анализу (РНКазному расщеплению, ДГГЭ, секвенированию), то рекомендуется провести еще одну серию амплификаций, с использованием другого набора олигонуклеотидных праймеров. Этот метод, именуемый nested oligo [22], состоит в следующем продукт первичной полимеразной цепной реакции используется в качестве матрицы в последующих раундах ПЦР, но уже с двумя другими олигонуклеотидами, имеющими гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифицированного фрагмента (рис. 6, Б). Такая процедура позволяет получить большое количество индивидуальной последовательности ДНК, несколько более короткой, чем исходный фрагмент, и использовать ее для последующего анализа. [c.139]

Поскольку в результате цепной амплификации образуются идентичные фрагменты специфичной ДНК, сразу же может быть осуществлено клонирование или секвенирование продуктов реакции. Матрицей для ПЦР-амплификации могут служить как геномная ДНК, так и кДНК, синтезированная путем обратной транскрипции РНК- Чувствительность метода позволяет обнаружить и амплифицировать единственную молекулу ДНК. При ЦР и наличии нерадиоактивных материалов полимеразная цепная реакция обещает стать в будущем стандартной молекулярно-биологической процедурой. Можно предположить, что велика будет и ее роль в диагностике наследственных и инфекционных заболеваний. [c.189]

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)—это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 10 раз [1, 2]. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает использование имеющегося образца ДНК-Некоторые области применения ПЦР высокоэффективное клонирование геномных последовательностей [3], прямое секвенирование митохондриальной и геномной ДНК [5—7, см. ниже], анализ вариаций нуклеотидных последовательностей [8] и выявление вирусных патогенов [9—И]. [c.176]

Фазмидные векторы так же как и фаговые, используют для клонирования кДНК и геномной ДНК. Эффективность упаковки рекомбинантных фазмид в фаговую головку с последующим инфицированием клеток Е. oh превосходит эффективность трансформации бактерий плазмидами в 100 раз. Это существенно облегчает конструирование банков генов, содержащих до миллиона независимых клопов, повышая тем самым вероятность изолирования редких клонов. И сам процесс скрининга в данном случае также существенно облегчен, так как рассев фагов на чашки может проводиться с высокой плотностью, а фон ложных ответов обычно мал (см. гл. 9). Однако большой размер фаговых и фазмидных векторов затрудняет рестрикционный анализ клонированных генов и их секвенирование, так что после нахождения [c.221]

Секвенирование клеточных геномов. Разработка автоматических секвенаторов существенно ускорила ироцесс анализа последовательностей и позволила приступить к секвенированию клеточных геномов, для которых предварительно составляют физические карты. Как правило, секвенируют по отдельности фрагменты геномной ДНК размером 40—200 т.п.н., клонированные с помошью космид, A-векторов, а также векторов типа YA , ВАС или РАС (см. с. 271). Для этого ДНК каждой вставки дробят случайным образом и субклоны секвенируют наугад. Далее составляют контиги, объединение которых завершает анализ фрагмента. Последовательная привязка фрагментов к физической карте генома позволяет контролировать процесс его секвенирования. Уже известна полная нуклеотидная последовательность нескольких клеточных геномов [c.309]

Исследование сател.гитных ДНК с помощью рестриктирующих эндонуклеаз. В исследовании природы сателлитных ДНК, как выделенных с помощью равновесного центрифугирования, так и криптических, большую роль сыграли опыты по эндонуклеазному расщеплению с последующей блот-гибридизацией. Значительно прояснили картину клонирование и секвенирование этих необычных геномных сегментов. [c.189]

Если сайт для какой-то рестриктирующей эндонуклеазы находится в каждом из повторов тандемного кластера, то такой кластер расщепляется на фрагменты, длина которых равна длине повторяющейся единицы (рис. 9.26,/4). При гель-электрофорезе суммарной геномной ДНК, окрашенной бромистым этидием, набор этих фрагментов одинаковой длины очень часто образует отдельную полосу. ДНК, элюированную из этой полосы, можно сразу подвергнуть предварительному секвенированию. Полученная таким образом каноническая консенсусная последовательность не обязательно соответствует последовательности любой из повторяющихся единиц, поскольку, как мы уже говорили, такие единицы в центромерных тандемных повторах редко бывают идентичными. Обычно они образуют семейство, члены которого отличаются друг от друга одним или более нуклеотидным остатком. Некоторые из них дивергировали в результате случайных нуклеотидных замен. Иногда нуклеотидные замены обнаруживаются сразу в нескольких или во всех единицах какой-то части кластера. Если часть кластера существенно отличается от сателлитной последовательности в целом, то говорят о субкластере или о сателлитном домене. Секвенирование клонированных сателлитных повторов, доменов и мономерных повторяющихся единиц показало, что то, что раньще представлялось совершенно гомогенной последовательностью, на самом деле есть совокупность в значительной степени различающихся единиц. [c.189]

Сателлитные последовательности у быка и мыши. У быка известны восемь разных сателлитных последовательностей (рис. 9.28). Все вместе они составляют более 23% геномной ДНК и, судя по кинетике реассоциации, занимают промежуточное положение между высоко- и умеренноповторяющимися последовательностями (см. разд. 9.1.6). Повторяющиеся единицы представлены набором взаимосвязанных последовательностей. Секвенирование показало, что по меньшей мере пять из восьми сателлитов содержат одну или более одинаковых последовательностей, хотя и дивергиро-вавших настолько, что не гибридизуются между собой, а рестрикционный анализ не выявляет их родства. Длина повторяющейся единицы у большинства сателлитов быка превышает 1 т. п. н. Внутри этих длинных повторяющихся единиц имеются повторы, встречающиеся более часто. [c.192]

Что касается генов -ИФН, то с ними ситуация еще не выяснена. Один из них расположен в коротком плече хромосомы 9 и уже секвенирован как и гены а-ИФН, он не содержит интронов. Однако вопрос о том, есть ли другие гены -ИФН, и где они расположены, остается открытым. С одной стороны Тавернье и др. [236] просмотрели геномную библиотеку человека и обнаружили только один ген -ИФН. С другой стороны Пита и др., [183] обнаружили мРНК -интерферона в гибридных клетках человек — мышь, не содержащих хромосомы 9, но содержащих хромосомы 2 и 5 человека. Сагар и др. [203] нашли по крайней мере пять видов транслируемой мРНК -ИФН а Сегал и др. [216], просматривая геномную библиотеку человека, нашли шесть дополнительных генов -ИФН. По-видимому, несколько генов -ИФН расположены в хромосомах 2, 5, и 9. И, наконец, существует единственный ген человеческого -ИФН, расположенный в хромосоме 12 [54, 164] и имеющий три интрона. [c.43]

Как уже отмечалось выше, для определения нуклеотидных последовательностей ДНК методом Максама-Гилберта необходимо наличие фрагментов ДНК, несущих на одном из концов какую-либо метку. Отдельные частные случаи секвенирования ДНК методом химической деградации (геномное и мультиплексное секвенирование, рассматриваемые в других главах) могут проводиться даже с немечеными препаратами ДНК. Концевое мечение секвенируемых фрагментов ДНК можно осуществить при помощи различных ферментов. Так, с помощью поли-нуклеотидкиназы фага Т4 и молекулы АТФ, несущей радиоактивный фосфор в у-положении, проводится мечение 5 -концов одно- или двуцепочечного фрагмента ДНК. Эффективность мечения тупых или 5 -углубленных концов двуцепочечного фрагмента ДНК значительно ниже, -чем 5 -выступающих. Для более эффективного мечения необходим предварительный этап дефосфорилирования фрагмента ДНК с помощью щелочной фосфатазы. Особая забота должна быть проявлена при последующем удалении щелочной фосфатазы, что достигается обычно фенольной депротеинизацией, так как остаточная фосфатазная активность может резко снизить эффективность этапа мечения. Мечение путем обменной реакции позволяет обойтись без этапа дефосфорилирования и требует присутствия в реакционной смеси в качестве акцептора молекул АДФ, однако эффективность мечения при этом будет значительно ниже. [c.22]

Смотреть страницы где упоминается термин Геномное секвенирование: [c.327] [c.375] [c.467] [c.175] [c.261] [c.134] [c.97] [c.175] [c.261] [c.92] [c.140] [c.142] [c.300] [c.353] [c.19] [c.89] [c.154] [c.287] [c.358] [c.372] [c.377] [c.382] [c.410]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология