Клонирующие векторы также

Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорную ДНК расщепляют лишь частично. При этом получаются фрагменты разной длины, из которых затем создают геномную библиотеку. Для клонирования крупных фрагментов ДНК были сконструированы векторы на основе бактериофагов X и Р1, а также плазмиды Р. [c.78]

Свойства любого белка зависят от его конформации, которая в свою очередь определяется аминокислотной последовательностью. Некоторые аминокислоты в полипептидной цепи играют ключевую роль в определении специфичности, термостабильности и других свойств белка, так что замена единственного нуклеотида в гене, кодирующем белок, может привести к включению в него аминокислоты, приводящему к понижению его активности, либо, напротив, к улучшению каких-то его специфических свойств. С развитием технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность производить специфические замены в клонированных генах и получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Такой подход получил название направленного мутагенеза. Как правило, интересующий исследователя ген клонируют в ДНК фага M13. Одноцепочечную форму ДНК этого фага копируют с использованием олигонуклеотидного праймера, синтезированного таким образом, чтобы в ген-мишень был встроен определенный нуклеотид. Затем трансформируют двухцепочечными ДНК M13 клетки Е. соИ. Часть образующихся в клетках фаговьгх частиц несет ген, содержащий нужную мутацию. Такие частицы идентифицируют, встраивают мутантный ген в экспрессирующий вектор, синтезируют белок и определяют его активность. Вносить изменения в клонированные гены можно также с помощью плазмид или ПЦР. Обычно заранее не известно, какую [c.175]

Особенности рестриктаз подкласса IIS используют также при создании специализированных клонирующих векторов, имеющих большое значение для сборки генов из химически синтезированных блоков. [c.21]

Благодаря созданию клонирующих векторов, способных реплицироваться и стабильно поддерживаться в разных грамотрицательных бактериях, появилась возможность получать библиотеки генов изучаемых бактерий, проводить молекулярно-генетические исследования организации и функционирования хромосомных и плазмидных генов, а также координируемо регулируемых наборов генов (оперонов). С помощью комплементационного анализа удается выявлять гибридные молекулы ДНК, несущие определенные локусы бактериальной хромосомы. При этом комплементация функций возможна и в неродственных, но относительно хорошо изученных бактериях. Рассмотрим некоторые исследования такого типа. [c.228]

С использованием генно-инженерных подходов удалось изучить расположение этих генов в ДНК, а также зарегистрировать изменения структуры хроматина и ДНК, связанные с регуляцией экспрессии этих генов. Как а-, так и Р-глобиновые гены образуют кластеры тесно сцепленных генов. Оба кластера генов были клонированы в виде набора рекомбинантных фаговых векторов, содержащих перекрывающиеся фрагменты глобиновых генов, с использованием методов, описанных в гл. 9. Расположение генов внутри кластеров показано на рис. 16.17. Интересно отметить, что некоторые глобиновые гены представлены более чем одной копией (aj, аг, °у, у), причем на соответствующей стадии развития происходит одновременная экспрессия обеих копий. Удивительной особенностью организации кластеров оказалось то, что гены в них расположены в соответствии Ф порядком их экспрессии и все транскрибируются с одной и той же цепи ДНК. [c.230]

Недавно был получен вектор, с помощью которого можно конструировать искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) [9]. Это открытие сулит переворот в картировании появляется возможность клонировать фрагменты ДНК, на порядок превышающие по размерам космидные вставки. Вероятно также, что соответствующие геномные библиотеки окажутся более представительными. Метод отпечатков пальцев (фингерпринт) пока пригоден лишь для маленьких YA , но, используя гибридизацию, можно будет присоединять к космидам и большие фрагменты. Скорее всего в будущем для картирования генома будет применяться техника подбора пар, специально разработанная для YA . [c.33]

Один из клонирующих векторов системы слияния, сконструированных для получения специфических антител, содержит 5 "-концевой сегмент гена ompF Е. соН, кодирующего один из наружных мембранных белков, и прилегающую к нему часть гена la Z (Р-галактозидазы) Е. соИ (рис. 6.7). Этот сегмент содержит информацию, необходимую для инициации транскрипции и трансляции химерного гена, а также для секреции химерного белка. Несмотря на то что укороченный ген la Z лищен кодонов для первых восьми аминокислот, кодируемый им белок сохраняет ферментативную активность. В такой [c.113]

Таким образом, к началу 90-х годов возможность экстрахромосомного поддержания трансгепа была неоднократно экспериментально подтверждена, а также был сформулирован принцип создания экстрахромосомных конструкций, заключающийся во внесении ARS-элемента в известный клонирующий вектор. В последующие годы исследования автономной репликации и транскрипции экстрахромосомных трансгенов сконцентрировались главным образом на модели трансфецированных (трансформированных) клеток [c.219]

Клонирующие векторы созданы также на основе некоторых других фагов бацилл, не только умеренных, но и вирулентных. Как видим, векторная система клеток В. subtilis на основе ДНК фагов разработана относительно хорошо. Для малоизученных умеренных фагов бацилл предложен метод статистической интеграционной встройки чужеродных генов in vivo в соответствующий профаг. Индуцируя измененные в процессе такой интеграции профаги, получают гибридное фаговое потомство, которое в одних случаях может быть дефектным (размножается в присутствии фага-помощника), а в других — жизнеспособным. По-видимому, такой подход конструирования гибридных фагов применим и к малоизученным умеренным фагам Е. соН. [c.262]

Чтобы из5 чить, как изменение структуры гена влияет на его экспрессию в клетках животных, необходимо использовать внехромосомные клонирующие векторы. Это обусловлено тем, что экспериментально почти невозможно добиться интеграции модифицированных форм гена в одну и ту же точку генома и исключить эффект положения гена. Частично этот вопрос удается решить, используя векторы на основе репликона вирусов SV40, полиомы, а также папилломы быка. Однако каждый из зтсазанных типов векторов имеет ограничения по спектру культур клеток, в которых они могут поддерживаться во внехромосомном состоянии. Поэтому возникла потребность в разработке дополнительных векторных систем, позволяющих клонировать и экспрессировать исследуемые гены внехромосомно в культивируемых клетках человека. [c.389]

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. [c.188]

На рис. 9 представлена схема конструирования клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора. Следует иметь в виду, что общие принципы получения клонотек генов приложимы и к любым другим векторам. На первом этапе конструирования осуществляют подготовку вектора и клонируемой ДНК. Космидный вектор расщепляют рестриктазами ВатШ и Smal, причем рестриктаза Smal расщепляет ДНК с образованием тупых концов. В результате образуются два плеча космидного вектора, содержащих область начала репликации ori, используемую системой репликации бактериальных клеток, и два селектируемых маркера, которые представляют собой гены устойчивости к антибиотикам - ампициллину (Атр ) и канамицину (КапО, а также два со -сайта хромосомы бактериофага X. Параллельно со всеми необходимыми предосторожностями получают препараты высокомолекулярной ДНК, которую необходимо клонировать. [c.156]

Для реализации замысла по созданию новой белковой молекулы имеется несколько экспериментальных путей, в том числе и химический синтез полипептидных цепей. Однако наиболее популярным подходом к получению совершенно новых, а также измененных природных белков, является их биосинтез in vivo или in vitro. В этом случае создают ген исследуемого белка, клонируют его в экспрессирующем векторе и далее осуществляют транскрипцию гена с последующей трансляцией образовавшихся мРНК. Замены аминокислотных остатков в исследуемом белке проводят целенаправленно, создавая мутации в определенных участках рекомбинантного гена, т.е. осуществляя процесс направленного мутагенеза. [c.286]

В специальную группу можно также выделить нуклеотидные последовательности ранних и других районов аденовирусов, папова-вирусов и герпесвирусов, которые клонированы в составе различных плазмидных векторов и обладают трансформирующим действием. Эти гены способны заменять по своему функциональному действию онкогены как ядерного , так и неядерного типа при тестировании их трансформирующей способности по комплементации с клеточными онкогенами при котрансформации нормальных клеток. [c.226]

Интерфероновые гены клонированы в экспрессирующих векторах в бактериальных и дрожжевых клетках, в клетках насекомых и млекопитающих. В качестве промоторов использовали переносные промоторы Пташне и сотр. [235], промотор фага Я, [55], промотор полиэдрина [224а] и промотор 1гр [78, 278]. Интерфероны также экспрессировали в виде гибридного белка [c.44]

Для более подробной характеристики глобипового гена необходимо получить больпюе количество его ДНК. Для этого клонируют к-ДНК в каком-нибудь векторе, ианример, в бактериальной плазмиде. Затем сравнивают фрагменты геномной ДНК, содержащие глобиновый ген, и клонированную к-ДНК, соответствующую м-РНК. Оказалось, что фрагменты геномной ДНК значительно больше, чем к-ДНК. В р-гемоглобиповом гене были выявлены две вставочные последовательности (интроны), которые разделяют три разные кодирующие области — эк-зоны. (Исследования многих других эукариотических генов, показали, что наличие интронов является правилом для большинства из них). Выяснилось также, что ген р-гемоглобина относится к уникальным последовательностям. Кроме того, были найдены псевдогены, имеющие мутации в колирующих и фланкирующих, регуляторных участках. Они называются псевдогенами, т.к. с них не идет транскрипция. [c.71]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология