ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Выделение индивидуальных белков из "Биологическая химия" Процедура выделения какого-либо белка начинается с переведения белков ткани в раствор. Для этого ткань измельчают и клетки разрушают с помощью специальных приборов — гомогенизаторов, или просто растиранием с песком. Нерастворимые части ткани из гомогената осаждают центрифугированргем. В надосадоч-ной жидкости (экстракте) содержатся растворимые белки. Если выделяемый белок прочно связан с какими-либо клеточными структурами, его можно перевести в раствор, обрабатывая гомогенат детергентами. В экстракте наряду с веществами небелковой природы присутствует много разных белков, причем искомый белок часто содержится в очень небольших количествах, составляющих десятые доли процента от всех белков. [c.54] Главная трудность выделения индивидуального белка состоит именно в его отделении от остальных белков. Все белки как соединения одного класса обладают сходными свойствами, и их фракционирование основано на небольших различиях в свойствах разных белков. В процессе выделения по возможности избегают денатурирующих воздействий работу проводят при температуре, близкой к О °С, не применяют сильнокислых или сильнощелочных растворов. [c.54] Избирательная денатурация. Многие белки денатурируются и выпадают в осадок при нагревании раствора до 50-70 °С или при подкислении примерно до pH 5. Если выделяемый белок выносит эти условия, то часть посторонних белков можно удалить из раствора таким способом. [c.54] Различия в растворимости. Чаще всего используют зависимость растворимости белков от концентрации сульфата аммония. Если в раствор белков добавить небольшое количество (КН )280 (например, 10 г на 100 мл раствора), то наименее растворимые белки выпадут в осадок. Осадок отделяют центрифугированием, а к надосадочной жидкости добавляют еще 10 г (КН )280 и получают второй осадок. Продолжая эту процедуру, получают ряд фракций в одной из них содержание искомого белка больше, чем в других. Сходным образом можно фракционировать белки добавлением возрастающих количеств ацетона или спирта. [c.54] Различия в количестве и природе ионогенных групп. Эти свойства позволяют фракционировать белки методами ионообменной хроматографии и электрофореза. [c.54] Для хроматографии белков применяют ионообменники на основе целлюлозы или других гидрофильных полимеров, например диэтиламиноэтилцеллюло-зу (ДЭАЭ-целлюлоза), содержащую катионные группы, или карбоксиметилцел-люлозу (КМ-целлюлоза), содержащую анионные группы (рис. 1.31). [c.54] Электрофорез для разделения белков применяют во множестве вариантов. На рис. 1.32 представлена принципиальная схема простейшего варианта — электрофорез белков на бумаге. В приборе для электрофореза имеются две вынимающиеся кюветы 7, разделенные перегородкой 2 на два отделения, которые соединяются между собой полоской фильтровальной бумаги 3 (электропроводящий мостик). В наружные отделения кювет опущены электроды 4, а во внутренние — концы бумажной полоски 5 на этих полосках происходит разделение белков. [c.55] На полоску 5 фильтровальной бумаги, пропитанной буферным раствором, наносят раствор белков и включают ее в электрическую цепь с постоянным током. Полоску бумаги, чтобы предотвратить высыхание, помещают в герметически закрытую камеру. Белки на электрофореграмме обнаруживают, обрабатывая полоску красителем, связывающимся с белками, обычно бромфеноловым синим или ами-довым черным (рис. 1.33, а). Такой метод малопригоден для выделения белков в количествах, достаточных для их дальнейшего изучения. Для получения больших количеств очищенного белка вместо полоски бумаги используют толстый блок какого-либо инертного материала — крахмала, целлюлозного порошка, или полимеры, образующие гели, — агар, полиакриламид. [c.55] На рис. 1.33 указаны основные фракции белков, их содержание в плазме (в % от суммарной концентрации белков в плазме) и положение некоторых индивидуальных белков (стрелки) 1 — а -антитрипсин 2 — гаптоглобин и церулоплазмин 3 — трансферрин 4 — фибриноген. [c.55] Различия по молекулярной массе позволяют разделять белки методами гель-фильтрации и ультрацентрифугирования. [c.56] Различия по специфичности к лигандам используются в методе, который называется аффинной хроматографией или хроматографией по сродству. В этом варианте хроматографии в качестве сорбента применяют инертный полимер с присоединенным к нему специфическим лигандом того белка, который хотят выделить. Суть метода и пример применения представлены на рис. 1.35 и 1.36. [c.56] Выделение индивидуального белка требует последовательного применения многих приемов (см. рис. 1.37 и табл. 1.9). Ход выделения контролируют по увеличению содержания вьщеляемого белка в препарате после каждой стадии. Концентрацию выделяемого белка в препаратах сравнивают по способности этих препаратов связывать специфический лиганд (функциональная активность), как это описано выше. Активность выражают в условных единицах, например в единицах поглош ения света (оптической плотности), и рассчитывают на 1 мл препарата. Активность ферментов измеряют по скорости катализируемой ими реакции (см. гл. 2). [c.58] В процессе очистки неизбежны потери выделяемого белка они связаны с денатурацией, а также с частичным попаданием выделяемого белка во фракции, которые отбрасываются. [c.59] При очистке каждого белка приемы и их последовательность подбираются эмпирически, методом проб и ошибок. Поэтому разработка процедуры выделения нового белка остается сложной и трудоемкой задачей. [c.59] Вернуться к основной статье