ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Ионизация, гидратация и растворимость белков из "Биологическая химия" Один из распространенных методов определения молекулярной массы белков и других высокомолекулярных веществ основан на измерении скорости седиментации (осаждения) веш еств при ультрацентрифугировании. Во враш аюш емся роторе ультрацентрифуги центробежное ускорение достигает 100 000-500 ООО g (g — ускорение свободного падения). На поверхность буферного раствора, налитого в кювету ультрацентрифуги, наносят тонкий слой раствора белка и кювету помешкают в ротор. При враш ении ротора молекулы белка, более плотные, чем растворитель, начинают перемеш аться в направлении от оси вращения. Положение белковой зоны в кювете в ходе центрифугирования регистрируется специальной оптической системой по показателю преломления, который больше в зоне белка, чем в буферном растворе. [c.43] Коэффициент седиментации большинства белков лежит в пределах 1-20 8, но может достигать и 200 8. [c.44] Молекулярная масса белка пропорциональна его коэффициенту седиментации, коэффициенту диффузии и плотности. Измерив в независимых опытах коэффициент диффузии и плотность, можно вычислить молекулярную массу Поскольку наибольшие трудности вызывает измерение коэффициента диффузии, нередко ограничиваются указанием только коэффициента седиментации белка, а также и других высокомолекулярных веш еств и частиц (208-белок, 608-частица, 188-РНК и т. д.). Эти величины позволяют оценить относительные размеры молекул и частиц, однако надо учитывать, что зависимость коэффициента седиментации от молекулярной массы нелинейная. [c.44] Более просто молекулярную массу белка можно определить методом гель-филь-трации, или молекулярного просеивания. Этот метод основан на применении специальных полимерных веш еств, набухшие зерна (гранулы) которых имеют поры определенного размера. Часто используют сефадекс, гранулы которого построены из трехмерной сети полисахаридных цепей декстрана. Небольшие молекулы растворенных веш еств легко диффундируют внутрь зерен сефадекса, в то время как диффузия крупных молекул затруднена. Это явление лежит в основе разделения веш еств (молекулярного просеивания) методом гель-фильтрации. [c.44] Продолжая пропускать буферный раствор через колонку и собирая вытекаю-шую из колонки жидкость небольшими порциями в ряд пробирок, получают фракции белков, различаюш ихся молекулярной массой белки вымываются (элюируются) из колонки в порядке убывания молекулярной массы. На этом основано определение молекулярной массы белков методом гель-фильтрации. [c.45] Между элюционным объемом и логарифмом молекулярной массы существует линейная зависимость (см. рис. 1.27). Элюционный объем зависит от размеров колонки, марки сефадекса, плотности его упаковки в колонке и других факторов. Поэтому колонку с сефадексом сначала калибруют. Для этого через нее пропускают растворы белков с известной молекулярной массой и строят калибровочный график, как показано на рис. 1.27. Затем через эту же колонку пропускают белок, молекулярную массу которого нужно узнать определяют его элюционный объем и по графику находят значение IgM, соответствующее этому объему. [c.45] В табл. 1.7 приведены значения молекулярной массы некоторых белков в табл. 1.8 представлены величины, характеризующие размеры и форму некоторых белков, и, для сравнения, размеры некоторых клеточных органелл и клеток. [c.45] Радикалы лизина, аргинина, гистидина и дикарбоксильных аминокислот содержат группы, способные к ионизации. Кроме того, на концах пептидных цепей имеются свободные а-аминогруппы и а-карбоксильные группы, которые тоже ионизируются. Ионогенных групп в молекуле белка может быть 15-20 на каждые 100 аминокислотных остатков. Таким образом, белки представляют собой полиэлектролиты. Поскольку белки содержат как положительно, так и отрицательно заряженные группы, они являются амфолитами. [c.46] При подкислении раствора белка степень ионизации анионных групп снижается, а катионных — повышается при подщелачивании происходят противоположные изменения. При определенном значении pH число пололсительно и отрицательно заряженных групп становится одинаковым такое состояние называется изоэлектрическим (суммарный заряд молекулы равен нулю). Значение pH, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии, называют изоэлектричес-кой точкой и обозначают р1. Изоэлектрическая точка большинства белков лежит в слабокислой зоне. Это связано с тем, что обычно в белках анионогенных аминокислот больше, чем катионогенных. Однако есть и щелочные белки, например гистоны, входящие в состав хроматина и содержащие много лизина и аргинина. [c.46] Если белок не находится в изоэлектрическом состоянии, то в электрическом поле молекулы белка будут перемещаться к катоду или аноду, в зависимости от знака суммарного заряда, и со скоростью, пропорциональной величине суммарного заряда (электрофорез). Этим методом можно разделять белки с различным значением р1. [c.46] Полярные группы белков, как ионогенные, так и неионогенные (см. табл. 1.3), способны взаимодействовать с водой, гидратироваться. Количество воды, связанной с белком, достигает 30-50 г на 100 г белка. Гидрофильных полярных групп (а соответственно и связанной с ними воды) значительно больше на поверхности белковой глобулы, чем в глубине, поэтому иногда говорят о гидратной оболочке белковой молекулы. Большинство белков имеет гидрофильную поверхность, однако есть и гидрофобные белки, поверхность которых образована преимущественно гидрофобными радикалами аминокислот. Такие белки нерастворимы в воде, но растворяются в липидах гидрофобные радикалы аминокислот взаимодействуют с молекулами липидов (сольватируются). Гидрофобные белки встречаются преимущественно в клеточных мембранах. [c.46] Растворимость белка в воде зависит от количества гидрофильных групп, от размеров и формы молекул, от величины суммарного заряда. В изоэлектрическом состоянии растворимость белков обычно снижена, поскольку отсутствует электростатическое отталкивание между молекулами, и они склонны образовывать многомолекулярные агрегаты, не способные удерживаться в растворе. [c.47] Растворимость белков зависит также от наличия других растворенных веществ. Например, некоторые белки не растворяются в дистиллированной воде, но растворяются в присутствии небольших концентраций нейтральных солей. При высоких концентрациях нейтральных солей белки выпадают в осадок, причем для осаждения (высаливания) разных белков требуются разные концентрации соли. Следовательно, этим способом можно фракционировать белки. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют сульфат аммония. После удаления соли (например, путем диализа) осажденный белок вновь растворяется при этом сохраняются его нативные свойства. [c.47] Растворимость белков снижается и при денатурации. Денатурацией нередко пользуются для удаления белков из растворов. [c.47] В клетке одни белки находятся в растворенном состоянии в цитозоле, другие входят в состав клеточных структур — мембран, рибосом, микротрубочек, фибрилл и др. Содержание белков в цитозоле равно примерно 20 %, в плазме крови 7-9 %. [c.47] Вернуться к основной статье