ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Использование гибридных поксвирусов для вакцинации домашних и диких животных из "Генетическая инженерия" Данные эксперименты по спасению маркера привели к разработке общей схемы введения чужеродных фрагментов ДНК в геном ортопоксвирусов. На первом этапе конструируют гибридную плазмиду, содержащую гетерологичный ген, фланкированный последовательностями вирусной ДНК из несущественной области вирусного генома. Полученную плазмиду вводят в клетки, инфицированные вирусом. За счет рекомбинации по областям гомологии между фланкирующими последовательностями в гибридной плазмиде и вирусной ДНК происходит встройка чужеродного фрагмента в геном вируса (рис. 14.31). Образовавшееся вирусное потомство более чем на 99 % состоит из вируса исходного типа, поэтому необходим метод селекции рекомбинантных вирусов. [c.392] НОГО субстрата Xgal приводит к окрашиванию бляшек таких рекомбинантных вирусов в синий цвет. [c.393] Другим фенотипическим маркером для отбора гибридных ортопоксвирусов может быть ген люциферазы светлячка. При этом следует отметить, что выявление встройки по активности люциферазы примерно в 1000 раз чувствительнее, чем по активности уЗ-галактозидазы. Это может оказаться удобным при изучении распространения (диссеминации) рекомбинантного вируса в тканях инфицированных животных. [c.393] Фенотипический отбор рекомбинантов можно осуществлять также либо используя спасение маркера определенных мутантов VA , либо идентифицируя мутантные клоны, возникающие в результате инсерции в целевые вирусные гены чужеродных последовательностей. Так, X. Шида с соавторами в 1987 г. показали, что встройка экзогенных фрагментов в ген гемагглютинина VA может быть выявлена по отсутствию адсорбции куриных эритроцитов в бляшках вариантов НА . [c.393] В лаборатории Э. Пэолетти установлено, что делеция гена K1L VA приводит к тому, что вирус теряет способность реплицироваться на линии клеток человека MR -5. Введение данного гена в геном мутантного вируса позволяет на культуре MR -5 эффективно селектировать рекомбинанты (1989 г.). [c.393] Щелкунова (2001-2003 г.) в геном вируса оспы коров последовательно ввели делеции по пяти различным генам. [c.395] Как видим, методология конструирования гибридных ортопоксвирусов, и прежде всего VA , разработана очень хорошо. Это позволяет получать самые различные варианты рекомбинантных вирусов. [c.395] Наиболее важным направлением в генетической инженерии VA является создание живых рекомбинантных вакцин, т. е. гибридных вирусов, экспрессирующих гены основных антигенных детерминант других микроорганизмов. Такие вакцины обьгано имеют значительные преимущества перед инактивированными (убитыми) вакцинами, так как обеспечивают более полноценный иммунный ответ на вирусные антигены (см. 17.3). Вирус осповакцины имеет широкий круг хозяев, что позволяет применять вакцины на его основе для разных видов животных в ветеринарии, а также при некоторых эпидемических ситуациях в медицине. VA успешно использовали для массовой вак-цинанции людей против оспы в течение многих лет. После 1980 г. в связи с глобальной ликвидацией оспы вакцинация против этой инфекции прекращена, так как риск осложнений, возникающих с определенной, хотя и небольшой, частотой при такой вакцинации, не оправдан. [c.395] Следует отметить, что инактивация в результате встройки целевых генов таких локусов VA , как гены тимидинкиназы, гемагглютинина и др., приводит к снижению вирулентных свойств вируса. Поэтому гибридные VA в большинстве случаев должны быть аттенуированными по отношению к исходному вирусу. Данному вопросу уделяется большое внимание, прорабатываются и различные альтернативные варианты. Так, в 1992 г. в лаборатории Э. Пэолетти предложили использовать в качестве молекулярного вектора при создании живых поливалентных вакцин вирус оспы канареек, который не реплицируется в клетках млекопитающих, но обеспечивает после вакцинации экспрессию целевых генов и иммунный ответ на их белковые продукты. [c.395] В последние годы в качестве безопасного вектора активно изучают штамм вируса осповакцины MVA, полученный германскими учеными в результате множественных пассажей VA на куриных эмбрионах в 1970-х гг. Штамм MVA является высокоаттенуированным вариантом вируса осповакцины, он способен in vitro размножаться на культурах клеток птиц, но практически не размножается в клетках млекопитающих. Тем не менее при вакцинации экспериментальных животных или людей рекомбинантными вариантами VA штамма MVA наблюдается эффективный иммунный ответ против целевых белков, чьи гены встроены в вирусный геном. Получаемые рекомбинантные MVA не вызывают побочных реакций при введении экспериментальным животным в очень высоких дозах. Предполагается, что VA штамма MVA можно будет использовать в качестве вектора для вакцинации даже иммунодефицитных людей. [c.395] Экспериментальная проверка показала, что в геном VA можно интегрировать не менее 25 тпн чужеродной ДНК. Геном такого гибридного вируса при пассировании стабильно сохраняет свою структуру. Поэтому на основе VA можно создавать поливалентные живые вакцины, т. е. варианты вируса, продуцирующего одновременно антигенные детерминанты нескольких инфекционных агентов. [c.395] Многочисленные исследования демонстрируют успешное использование вируса осповакцины в качестве вектора для конструирования эффективных живых вакцин против различных вирусных инфекций (табл. 14.1). [c.395] ИЛИ выключать экспрессию гена VA в любое время и изучать, как это влияет на репликацию и морфогенез вируса. [c.399] Как отмечалось выше, вирус осповакцины имеет широкий круг чувствительных животных. Поэтому гибриды на его основе можно использовать в качестве живых вакцин против различных инфекций разных видов животных. Важным достоинством поксвирусов также является их высокая устойчивость, по сравнению с другими вирусами, к воздействию внешних физических факторов, например температуры. [c.400] Вернуться к основной статье