ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Плазмидные векторы на основе элементов генома вируса Эпштейна-Барр из "Генетическая инженерия" С другой стороны, герпесвирусы млекопитающих представляют несомненный интерес для создания живых ветеринарных вакцин. Вирус, находящийся в латентном состоянии и продуцирующий при этом чужеродный антиген, должен обеспечивать надежную защиту организма от соответствующего инфекционного агента. Кроме того, гибридный вирус в латентной форме потенциально может излечивать определенные дефекты инфицированного организма по продукции того или иного полипептида. [c.387] Использовать в качестве молекулярного вектора герпесвирус кошек (FHV) попытались Г. Коль с соавторами (1990 г.). В ген тимидинкиназы FHV рекомбинационно встраивали либо ген env, либо ген gag вируса лейкемии кошек (FeLV), объединенный с ранним промотором цитомегаловируса человека. Клетки, инфицированные гибридными вариантами FHV, продуцировали соответствующие чужеродные белки. Заражение кошек гибридами приводило к формированию в их организме иммунного ответа на синтезируемые белки FeLV. Таким образом, герпесвирус юшек можно рассматривать как основу для создания живых поливалентных вакцин против ряда инфекционных заболеваний этих животных. [c.388] В 1981 г Д. Влажны и Н. Френкель показали, что после трансфекции культуры клеток кролика смесью нативной ДНК вируса простого герпеса и мономерной повторяющейся единицы (8,3 тпн) дефектного HSV-1 образуется полноразмерный (около 150 тпн) дефектный геном, состоящий из тандемных повторов введенного фрагмента 8,3 тпн. По-видимому, такой вирусный геном получался в результате репликации мономерной единицы по механизму катящегося кольца. При этом нативная ДНК HSV-1 обеспечивала транс-функции, необходимые для репликации и созревания вирусной ДНК. Дефектный геном эффективно упаковывался в капсиды. Аналогичные результаты были получены в 1982 г, когда в клетки кролика котрансфекцией с нативной ДНК HSV-1 ввели повторяющийся 5й Л1-фрагмент (3,9 тпн) дефектного вируса простого герпеса штамма Patton. [c.388] Таким образом, с помощью HSV-ампликона можно эффективно амплифицировать чужеродную генетическую информацию в клетках животных. Более того, если ампликон объединен с бактериальной плазмидой, то, выщепляя из дефектного генома гибридного вируса повторяющуюся единицу, можно восстановить исходную гибридную плазмиду и размножать ее в бактериальных клетках. При необходимости плазмиду можно снова ввести в клетки животных совместно с вирусом-помощником или его ДНК. [c.389] Векторная система ампликона вируса простого герпеса имеет ряд особенностей, отличающих ее от эукариотических векторов других типов. Гибридная ДНК, состоящая из ампликона, соединенного с чужеродной последовательностью, реплицируется по механизму катящегося кольца и упаковывается в капсид как линейная молекула размером около 150 тпн. Поэтому в данном случае можно клонировать фрагменты ДНК, значительно варьирующие по длине. Также необходимо отметить, что популяция вирусов, содержащая гибридные дефектные геномы, может быть использована для инфекции практически любых культур клеток млекопитающих. [c.389] Чтобы из5 чить, как изменение структуры гена влияет на его экспрессию в клетках животных, необходимо использовать внехромосомные клонирующие векторы. Это обусловлено тем, что экспериментально почти невозможно добиться интеграции модифицированных форм гена в одну и ту же точку генома и исключить эффект положения гена. Частично этот вопрос удается решить, используя векторы на основе репликона вирусов SV40, полиомы, а также папилломы быка. Однако каждый из зтсазанных типов векторов имеет ограничения по спектру культур клеток, в которых они могут поддерживаться во внехромосомном состоянии. Поэтому возникла потребность в разработке дополнительных векторных систем, позволяющих клонировать и экспрессировать исследуемые гены внехромосомно в культивируемых клетках человека. [c.389] Челночные плазмиды на основе генетических элементов EBV могут быть использованы для клонирования и экспрессии генов в культурах клеток человека в целях пол5 ения белковых продуктов, максимально соответствующих природным белкам человека. Они позволяют также исследовать влияние разных культур клеток на уровень экспрессии клонированных генов и природу продуцируемых ими полипептидов (конформацию, посттрансляционную модификацию, специфический транспорт и др.). Мутагенез генов и экспрессия этих измененных вариантов в составе EBV-векторов позволяет проводить тонкий молекулярно-генетический анализ их функционирования. [c.390] Вернуться к основной статье