ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Статистический мутагенез гибридных Сегмент-направленный мутагенез из "Генетическая инженерия" Интересен вариант мутагенеза молекул ДНК за счет встройки в случайные места экзогенных сегментов ДНК — природных фрагментов или синтетических линкеров (см. рис. 6.1, в). Случайные двухцепочечные разрывы можно вводить в молекулы ДНК путем кратковременного воздействия на них небольшого количества панкреатической ДНКазы I в присутствии катионов Мп2+. Получить молекулы ДНК с одиночными разрывами в разных местах можно, обрабатывая их рестриктазой, имеющей много участков узнавания на данном субстрате, так чтобы каждая молекула ДНК гидролизовалась в среднем лишь по одному участку. Таким образом, в частности, был получен первый гибридный фаг М13тр1 (см. 2.2.6). [c.173] Более сложный метод введения делеций in vitro приведен на рис. 6.1, г. Все показанные на рис. 6.1 варианты конструирования мутантов (за исключением б) приложимы и к линейным молекулам ДНК, например ДНК фага Я, и читатель сам может представить схемы этих процедур. [c.173] Вводя делеции или инсерции in vitro, можно достаточно легко локализовать функциональные элементы или кодирующие последовательности клонированных генов. Для более тонкого анализа организации гена (белка) необходимо использовать методы мутагенеза. Проще всего большое разнообразие мутаций можно получить при статистическом мутагенезе клонированного гена. Самый доступный вариант — общий мутагенез гибридной ДНК, содержащей целевой ген. Основным недостатком данного подхода является то, что мутагенез затрагивает все генетические локусы обрабатываемой молекулы ДНК. Поэтому при увеличении глубины мутагенеза, т. е. введении нескольких мутаций на молекулу, наряду с искомыми могут возникать мутации и по жизненно важным функциям вирусной или плазмидной ДНК. Такие молекулы ДНК уже будут нежизнеспособны и после трансфекции (трансформации) реплицироваться в клетках не будут. [c.173] Несомненно, статистический мутагенез плазмидных ДНК методически гораздо проще, чем направленный, и его целесообразно использовать при решении ряда вопросов. При желании мутагенной обработке можно подвергать изолированные фрагменты ДНК и затем вводить их в изучаемый геном. В этом случае будем иметь дело с одним из вариантов сег-мент-направленного мутагенеза. [c.175] Чу с соавторами (1979 г.) обрабатывали гидроксиламином определенные E oRl-фрагменты ДНК вируса простого герпеса и затем вводили их в чувствительные клетки животных одновременно с неповрежденной ДНК вируса дикого типа. Мутагенизированные фрагменты за счет генетической рекомбинации встраивались в вирусный геном, в результате чего были отобраны температурно-чувствительные (ts) мутанты вируса. Причем расположение мутаций было ограничено участками генома, покрываемыми соответствующими E oRl-фрагментами. [c.175] Похожие эксперименты выполнили Т. Вол-кер и М. Шоу (1980 г), но в данном случае мутагеном обрабатывались целиком гибридные плазмиды, содержащие Б ЛГфрагменты генома фага Т4. Затем за счет рекомбинации in vivo фрагменты фаговой ДНК встраивались в соответствующие им районы фагового генома. В результате получены мутанты фага по локализованным областям ДНК. [c.175] Активацию алкилирующей группировки R3 проводили после формирования специфичного ДНК-РНК гибрида. В результате данной, процедуры удалось эффективно (3-12 %) инактивировать выбранный ген, не затрагивая другие области фагового генома. [c.176] В ходе ограниченной полимеразной реакции (в реакционной смеси отсутствовал dGTP, см. рис. 6.6), инициированной на одноцепочечном разрыве молекулы ДНК, N-4-гидрокси d TP включался вместо dTTP. После трансформации клеток Е. соИ модифицированной плазмидной ДНК было обнаружено, что около 2 % плазмид утратило участок узнавания рестриктазой J oRI. Семь таких плазмид выделили и секвенировали их в районе oRI-участка. Оказалось, что три из них имели одиночную замену, три — две замены и одна — три замены. Во всех случаях, как и ожидалось, произошла транзиция ТА - G. [c.176] ЭТОМ на двухцепочечной ДНК данная реакция не идет. В качестве субстрата воздействия бисульфита можно использовать либо молекулу ДНК с одноцепочечной брешью, либо гетеро-дуплексную молекулу с одноцепочечной петлей (рис. 6.8). При полимеразной застройке мутаге-низированной бреши или репликации гетеро-дуплексной молекулы с U спаривается А, и при дальнейшей репликации в клетках Е. соИ формируется потомство мутантных молекул ДНК с транзициями G ТА. Выход мутантов при этом может достигать 20 % и более. [c.178] При использовании методов включения аналогов нуклеотидов или мутагенеза бисульфитом одноцепочечных брешей (см. рис. 6.6, 6.8) на молекуле двухцепочечной ДНК необходимо специфично осуществлять разрыв одной цепи. [c.178] Более широкий спектр транзиций, по сравнению с рассмотренными вьыпе мутагенами, дает азотистая кислота. Она дезаминирует цитозин до урацила, аденин до гипоксантина и гуанин до ксантина (см. рис. 6.7). В ДНК спаривание урацила с аденином приводит к тран-зиции G - ТА. Особенности спаривания гипоксантина таковы, что он может вызывать тран-зицию АТ - ОС. Ксантин не обусловливает мутаций. Он является бессмысленным основанием, которое не комплементарно обоим пири-мидинам, и, следовательно, его появление в молекуле ДНК должно оказывать летальное, а не мутагенное действие. [c.180] Интересный способ сегмент-направленного мутагенеза предложен В. А. Гусевым с соавторами (1981 г). Он основан на том, что РНК-полимераза в местах своего связывания с ДНК локально расплетает цепи, и на эти участки можно направленно воздействовать мутагенами, специфичными к одноцепочечным участкам ДНК (гидроксиламин и его О-алкил-производ-ные, бисульфит натрия). На примере ДНК фага Я было показано, что таким образом можно направленно вводить мутации по промоторно-операторной области pror с уровнем мутагенеза около 10 %. [c.180] Вернуться к основной статье