ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Эффект дозы гена при молекулярном клонировании из "Генетическая инженерия" В классической генетике хорошо известен так называемый эффект дозы гена, заключающийся в том, что увеличение в геноме какого-либо организма количества копий определенного гена вызывает пропорциональное повышение уровня его белкового продукта. С появлением методологии генетической инженерии использование эффекта дозы гена стало первым шагом к повышению выхода белковых продуктов клонируемых генов. Высокая доза гена достигается благодаря использованию многоко-пийных векторов, создаваемых для клеток Е. соИ на основе ДНК фагов и плазмид. [c.139] Для конструирования многокопийных плазмидных векторов используют плазмиды либо с ослабленным контролем репликации, либо с термочувствительными мутациями по функции репликации. Из векторов первого типа широкое распространение получили плазмида oIEl и ее многочисленные производные (см. 2.2.1), находящиеся в обычных условиях в клетке в количестве 20-60 копий. [c.139] Особенностью рассмотренных термоиндуцируемых плазмид является то, что в результате их интенсивной репликации клетки Е. соН погибают. Однако это обычно не имеет особого значения, так как после индукции нас прежде всего интересует прод)тст клонированного гена, а не жизнеспособность клетки. [c.141] Как видим, плазмиды обеспечивают широкие возможности для повышения дозы клонируемых в их составе чужеродных генов, а следовательно, и для увеличения продукции соответствующего белка. [c.141] что приводит к репликации фаговой ДНК. Такие фаги полностью дефектны по большинству ранних и по поздним функциям (в результате терминации транскрипции на tRi), и поэтому при инфекции непермиссивных клеток фаг развивается как плазмида, которая обеспечивает высокую дозу гена и не лизирует бактериальные клетки. Как видим, для фага Я существуют два альтернативных варианта, позволяющих предотвратить лизис клеток и обеспечить высокую копийность клонированных в составе фагового генома чужеродных генов. [c.141] Рассмотренные примеры показывают, что, используя мзтанты фага А, обеспечивающие повышенную копийность фагового генома и предотвращающие упаковку этого генома в белковый капсид, можно достигать высокой дозы клонируемого гена, а следовательно, значительного увеличения синтеза белка, детерминируемого этим геном. [c.142] Несомненный интерес представляют также векторы на основе ДНК нитевидных фагов. Эти фаги при инфекции не лизируют клетки Е. соИ, обеспечивая высокую копийность клонированного гена и высокий выход кодируемого им белка. [c.142] Таким образом, применение многокопийных векторов позволяет во многих случаях иметь в клетке очень высокий уровень белковых продуктов клонированных генов. Именно поэтому некоторые сегменты ДНК не могут быть клонированы в таких векторах, поскольку детерминируемые ими белки при повышенной продукции вносят значительные нарушения в физиологию бактериальной клетки. Обычно эти гены удается клонировать в низкокопийных векторных ДНК, например в плазмиде pS lOl и ее производных, или в многокопийных векторах экспрессии со строгим регулированием транскрипции. В последнем случае необходимо клонировать не весь ген, а только его кодирующую часть. [c.142] Вернуться к основной статье