ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Клонирующие векторы на основе нитевидных фагов из "Генетическая инженерия" Максимальный размер фрагментов ДНК, которые можно клонировать в фазмидах, обычно несколько меньше допустимой величины встройки для векторов на основе ДНК фага Я (этот размер легко высчитать, зная величину вектора см. 2.2.2). Фазмиду выделяют из клеток в виде плазмиды, гидролизуют определенной рестриктазой и лигируют с продуктами неполного гидролиза изучаемой ДНК, после чего проводят упаковку ДНК в капсиды фага Я. [c.109] НОСИТСЯ в цитоплазму клетки. Бактериальные полимеразы осуществляют синтез второй, (-)-цепи, образуя двухцепочечнзто репликативную форму (РФ) фагового генома. Синтез второй цепи инициируется на ori -), расположенном в межгенной области IR (рис. 2.26). На молекулах РФ осуществляется транскрипция и последующая трансляция фаговых генов. Белок рП вносит разрыв в (+)-цепь РФ в участке огг(+), также расположенном в межгенной области IR. Это приводит к репликации фаговой ДНК по модели катящегося кольца с высвобождением (+)-цепи. По заверщении цикла белок рП лигирует концы образовавшейся одноцепочечной (+) ДНК. На ранних этапах инфекции новые (+)-цепи служат в качестве матриц для образования дополнительных молекул РФ, однако по мере накопления фагового белка pV, связывающего оцДНК, процесс формирования РФ тормозится. Копийность РФ составляет 200-300 молекул на клетку. [c.111] Длина вирионов зависит от величины фагового генома и может варьировать в широких пределах. Длина частиц гибридного фага увеличивается пропорционально размеру пакующейся ДНК. Образующиеся при инфекции фаговые частицы постоянно экскретируются клетками без лизиса последних, и этот процесс является энергозависимым. За одну генерацию образуется несколько сотен фагов на клетку. [c.111] Скорость роста заражежых клеток на 25-50 % ниже, чем неинфицированных. Поэтому при титровании нитевидные фаги образуют на бактериальном газоне мутные бляшки. При размножении нитевидных фагов в бактериальной клетке их геном одновременно присутствует в виде большого числа копий двухцепочечной кольцевой плазмиды и одноцепочечной ДНК в составе вирионов. Из одного литра инфицированной культуры получают несколько миллиграммов одноцепочечной и репликативной двухцепочечной форм фаговой ДНК. На одноцепочечной вирионной ДНК многие манипуляции по созданию гибридных молекул, разработанные для вирусных и плазмидных двухцепочечных ДНК, реализовать нельзя. Однако они с успехом применимы к репликативной форме генома нитевидных фагов, которая инфекцион-на в тесте трансфекции клеток Е. oli. Все это обусловило использование нитевидных фагов для создания клонирующих векторов. [c.111] Наибольший интерес для молекулярных биологов в /ас-опероне представляет ген la Z. Продукт этого гена—уЗ-галактозидаза ф-GaX) — легко определяется по специфической ферментативной активности (см. 2.2.2). Более того. [c.113] Кроме векторов — производных фага М13 получен ряд векторов на основе фагов fd и fl. На рис. 2.32 приведена структура нескольких векторных вариантов фага fd, которые были сконструированы по стратегии, разработанной при получении фага М13тр1. В данном случае векторные фаги обусловливают устойчивость к антибиотикам, и поэтому инфицированные ими клетки способны расти на питательной среде с соответствующим антибиотиком. При этом клоны клеток Е. oli, инфицированных (трансфицированных) гибридными фагами, легко выявляются на селективных средах. [c.117] ВИДНЫХ фагов используют для экспрессии чужеродных генов в клетках Е. oli. Особое направление исследований, использующее векторную систему нитевидных фагов, получило название фаговый дисплей. [c.118] Вернуться к основной статье