ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Подсчет бактерий с помощью эпифлюоресцентной микроскопии из "Мембранная фильтрация" В описанном Франциско и др. [77] первоначальном эпифлюоресцентном методе для подсчета водных бактерий применялись обычные мембраны черного цвета, которые, по-видимому, до сих пор являются наиболее удобными. Размеры многих водных бактерий весьма малы, поэтому следует применять мембраны с размером пор 0,2 мкм. Важно, чтобы мембраны сами не флюоресцировали. Для этого необходимо проверять каждую партию мембран, так как некоторые изготовители применяют красители, которые обнаруживают значительную авто-флюоресценцию. Вполне удовлетворительными были мембраны черного цвета, выпускаемые одно время фирмой Миллипор компани , но в 70-е гг. был заменен краситель, что привело к значительному увеличению фоновой флюоресценции [56]. В настоящее время наиболее подходящими являются нитро-целлюлозные мембраны черного цвета, производимые фирмой Сарториус [120]. Однако потребитель должен критически относиться к некоторым изделиям, поскольку технология производства нередко меняется, о чем потребителя не ставят в известность. [c.214] В разд. 8.3 мы описали метод окраски мембран Нуклепор в черный цвет. Мембраны следует проверять на равномерность смачивания, так как некоторые партии мембран Нуклепор были частично гидрофобными [108], хотя эта проблема, по-видимому, была уже решена путем изменения производственного процесса [55]. [c.214] Хобби и др. [108] предложили метод, согласно которому бактерии подсчитываются во влажном состоянии. После того как вся вода прошла через мембрану (промывка необязательна), ее помещают на предметное стекло микроскопа, добавляют каплю масла, кладут сверху покровное стекло и снова добавляют каплю иммерсионного масла, для того чтобы можно было использовать иммерсионный объектив. [c.215] Циммерман и Мейер-Рейл [244] предложили другой подход, а именно изопропанольный метод получения сухого препарата. Согласно этому методу, необходимость в черных мембранах отпадает, поскольку краситель, связавшийся с мембраной Нуклепор, все равно обесцвечивается изопропанолом. Водную пробу без красителя фильтруют досуха, после чего мембрану, не вынимая ее из фильтродержателя, обрабатывают 0,5 мл водного раствора акридинового оранжевого (1 10 000) в течение 1 мин. Краситель затем удаляют, отфильтровывая его под вакуумом через мембрану в слив, после чего добавляют и таким же образом (т. е. отфильтровывая под вакуумом) немедленно удаляют 1 мл изопропанола. После этого мембрану снимают с фильтродержателя, сушат на воздухе, режут на куски клиновидной формы и устанавливают на предметном стекле, покрытом фиксирующей смесью (коричный альдегид и эвгенол в соотношении 2 1). Чтобы избежать постепенного высвобождения несвязанного красителя из остатков растительной ткани, что приводит к уменьшению контрастности, с помощью фильтровальной бумаги под покровное стекло затягивают немного больше фиксирующей смеси, которая замещает тем самым жидкость, содержащуюся в частицах бактерий. Хотя этот метод и более громоздкий, чем упомянутый выше метод Хобби и др. [108], с его помощью получают препараты, которые могут храниться сравнительно долго, что избавляет от необходимости проводить счет бактерий сразу после их фильтрации. [c.215] Существует еще один метод, который может быть удобен для взятия проб в полевых условиях. В этом методе мембрану высушивают сразу же после фильтрации без ее окрашивания [55]. Позднее мембраны окрашиваются и вновь увлажняются прямо на стеклах для счета с помощью разбавленного раствора акридинового оранжевого. Такой способ исключает проблему переноса водных проб, взятых в полевых условиях, но, прежде чем применять его в конкретной обстановке, его необходимо проверять для надежности. [c.216] Большинство исследователей, применяющих эпифлюоресценцию для счета, указывают, что фиксация водных проб в формальдегиде или глутаровом альдегиде позволяет их сохранять долгое время. Однако Дейли [55] рассматривает некоторые возможные осложнения, связанные с фиксацией и вызванные лорчей альдегида при окислении. Он рекомендует применять -5 %-ный раствор свободного от кислоты глутарового альдегида в буфере, очищенном для предотвращения окисления аргоном. [c.216] Хобби и др. [108] дают рекомендации в отношении того, как следует выбирать элементы оптической системы микроскопа (формирующий и отсекающий светофильтры, дихроичное зеркало). При работе с акридиновым оранжевым формирующий светофильтр должен пропускать свет в голубой области спектра (420—430 нм), а отсекающий светофильтр отсекать весь свет с длинами волн меньше 500 нм. При этих условиях в отсутствие флюоресценции изображение будет совершенно черным. Следует заметить, что для успешной работы должны использоваться надлежащие светофильтры и источник света большой мощности (ртутная лампа мощностью 200 Вт). Поскольку соответствующее оборудование выпускается многими фирмами, мы не приводим здесь конкретных рекомендаций. (За подробностями читатель может обратиться к работе [120].) Потенциальному покупателю мы можем лишь посоветовать, чтобы он не принимал на веру рекомендаций изготовителя или агента по продаже, а обязательно проверил прибор сам, прежде чем его приобрести. Поскольку в большинстве случаев эпифлюоресцентную микроскопию применяют для биомедицинских исследований без применения мембранных фильтров, когда имеют дело с флюоресцирующими антителами, соответствующее оборудование производится прежде всего для этих целей. [c.216] Для того чтобы можно было правильно и быстро производить счет, окуляр должен быть снабжен сеткой. Ее помещают в окуляре строго в фокальной плоскости. Большинство изготовителей продают окуляр с регулируемым фокусом, что особенно удобно при работе с сеткой. [c.216] Следует также подчеркнуть, что объектив микроскопа, используемый для эпифлюоресцентного счета, должен обладать способностью пропускать максимальное количество света. Фазово-контрастные объективы с вделанными в них фазовыми пластинками, как правило, для этого непригодны. Среди объективов, предназначенных для микроскопии методом светлого поля, нужно выбрать тот, который имеет большую числовую апертуру. Однако сильное увеличение не только не нужно, пО даже нежелательно, поскольку оно влечет за собой снижение интенсивности изображения. Лучше пользоваться маломощными окулярами. По сравнению с обычной микроскопией флюоресцентная микроскопия так же, как и темнопольная, позволяет разглядеть клетки значительно меньших размеров, поскольку каждая клетка в этом случае представляет собой точечный источник света. Многие затруднения при эпифлюоресцентном счете, которые упоминаются в литературе [55, 108],. могут быть вызваны как ошибками при самом микроскопическом исследовании, так и тонкостями процесса мембранной фильтрации. Если соблюдены все предосторожности, то под. микроскопом мы увидим ярко светящиеся бактерии на совершенно черном фоне (рис. 8.3). [c.217] ДО его забивания можно пропустить лишь небольшой объем молока (0,01 мл), а чтобы достичь чувствительности, достаточной для бактериального счета, нужно профильтровать по меньшей мере 2 мл молока. Петтифер и др. предлагают с целью улучшения фильтрационной способности молока обрабатывать его протеазой с последующим разбавлением каким-либо по-верхностно-активным веществом. Главная цель такой обработки состоит в том, чтобы лизировать попавшие в молоко клетки ткани животного, которые намного крупнее бактерий и количество которых может быть примерно таким же, как и количество бактерий. Читатель, подробно интересующийся этим вопросом, может обратиться к статье [167]. [c.219] Вернуться к основной статье