ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК ферментативным методом по Сэнгеру праймерной прогулкой из "Секвенирование ДНК" Независимо от типа праймерных молекул, представляющих собой или единый олигонуклеотид, или состоящих из отдельных модулей, общая стратегия секвенирования ДНК праймерной прогулкой , приведенная на рис. 8.21, остается неизменной. Некоторое отличие реально осуществляемых проектов от того, что приведено на данной схеме, и направленное на ускорение выполнения проекта по определению нуклеотидной последовательности ДНК, заключается в одновременном секвенировании вставки с обоих концов клонированного фрагмента или даже еще с какого-либо произвольного места вставки, что позволяет накапливать данные соответственно в два или три раза быстрее (кратность ускорения зависит от исходного числа точек, с которых начинается секвенирование и праймеров к ним). При этом праймерами для секвенирования краев вставки обычно служат стандартные секвенирующие праймеры, комплементарные соответствующим участкам векторной молекулы. [c.283] Другой тип олигонуклеотидных молекул при осуществлении праймерной прогулки описан в статье Фу и соавт. [Fu et al., 1995]. Ими был применен одно/двуцепочечный праймер, формируемый путем отжига 23-членного и 18-членного олигонуклеотидов, что привело к образованию на одном из его З -концов 5 выступающих нуклеотидов. Авторы цитируемой статьи делают заключение, что предсинтезированная библиотека подобных праймеров будет меньше, чем состоящая из более привычных гексамеров, поскольку все возможные варианты 5 неспаренных нуклеотидов приведут к существованию всего 1024 (4 ) таких олигонуклеотидов. Принцип же использования подобных праймеров заключается в образовании затравочного комплекса для ДНК-полимеразы путем их отжига на одноцепочечном участке фрагмента ДНК, образуемого подходящей рестрикционной эндонуклеазой (например АраШ), и удерживаемых на одноцепочечной матрице ДНК также за счет стэкинг-взаимодействия. [c.284] СИ С помощью магнитных частиц со стрептавидином различных фрагментов ДНК, не несущих молекулы биотина, продукт линейной ПЦР амплифицировался уже экспоненциально при помощи этого же и второго праймеров, причем второй праймер отжигался на олиго-кассете. Таким образом, еще через 35 циклов появлялся двуцепочечный продукт ДНК, часть последовательности которого была известна, а другую часть предстояло определить. Такая схема последовательного определения все новых и новых участков ДНК может действовать и дальше и поэтому авторы назвали свой подход в нашем несколько вольном переводе геномной прогулкой с олиго-кассетой . [c.285] Вернуться к основной статье