ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК ферментативным методом по Сэнгеру с помощью направленного подхода из "Секвенирование ДНК" Задачи, стоящие перед исследователями, требовали определения нуклеотидных последовательностей довольно протяженных фрагментов ДНК, которые не могли быть прочитаны за одно электрофоретическое разделение продуктов секвенирующих реакций. В первые годы секвенирования ДНК предел чтения с радиоавтографа геля редко превышал 250-300 нуклеотидов для одной матрицы. Да и фермент ДНК-полимераза I, ее Кленовский фрагмент, имея низкую процессивность, не мог эффективно строить комплементарную цепь ДНК большой протяженности. Метод химической деградации вкупе со стандартным гель-электрофорезом того времени также не позволял читать более 250-300 нуклеотидов. В связи с этим решение проблемы секвенирования больших вставок, нуклеотидные последовательности которых не могли быть определены в одном эксперименте, заключалось в выработке специальных подходов. С течением времени, благодаря различным новшествам, разрешающая способность методов секвенирования заметно возросла и за счет этого увеличился оптимальный размер вставок до 500 и 1000 пн, позволяющий определить их последовательность в процессе одного электрофоретического разделения. Резко возросли и задачи, предполагающие уже определение нуклеотидных последовательностей еще более крупных фрагментов ДНК или даже целых геномов. Все это привело к разработке большого числа различных стратегий секвенирования протяженных фрагментов ДНК, к рассмотрению которых мы и приступаем. [c.234] Все рассмотренные выше стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК методом Максама-Гилберта нельзя отнести к стратегиям случайного подхода, так как они основывались, как правило, на знании рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК и были рассчитаны на получение конкретных субфрагментов ДНК или субклонов. В то же время возможность случайного раздробления крупного фрагмента ДНК физическими методами и получение на их основе субклонов для их последующего секвенирования методом химической деградации принципиально возможны, хотя и не производительны. При этом, однако, необходимо отметить, что совершенствование векторных систем и их использование для определения нуклеотидных последовательностей протяженных фрагментов ДНК химической деградацией по Максаму-Гилберту не смогло значительно повысить производительность этого метода, разве что, кроме, метода мультиплексного секвенирования. [c.237] Первым таким меченым зондом служит синтезированный олигонуклеотид, комплементарный участку секвенируемой ДНК с известной последовательностью. Следующий, очередной зонд подбирают на основе уже определенной в предыдущем цикле нуклеотидной последовательности. Причем синтез такого олигонуклеотида, комплементарного той или иной цепи, позволяет осуществлять как секвенирование нового участка, так и подтверждающее секвенирование в обратном направлении. [c.239] Следует отметить, что метод мультиплексного секвенирования получил дальнейшее развитие при определении нуклеотидных последовательностей ДНК ферментативным методом и поэтому в соответствующем разделе 8.6 данной главы рассмотрен более подробно. [c.239] Отсутствие необходимости предварительного рестриктазного картирования протяженной вставки является важным преимуществом стратегий случайного подхода и позволяет экономить много времени и усилий на данном этапе, а также и на этапе лигирования, который проводится только один раз со всем множеством получаемых мелких фрагментов ДНК. Поскольку для получения серии подобных субклонов фрагментация ДНК осуществляется произвольным образом или с помощью ферментов, или физическим воздействием, то знания рестриктазной карты совершенно не требуется. Однако клонирование таких случайных фрагментов приводило, подчас, к многократному секвенированию одних и тех же участков ДНК, что имело, впрочем, некоторое положительное значение, увеличивая достоверность нуклеотидной последовательности ДНК ввиду ее многократного прочтения , да еще и в обоих направлениях. В то же время отдельные фрагменты иногда никак не удавалось субклонировать и секвенировать. [c.240] Обязательным важным этапом при определении нуклеотидной последовательности ДНК случайным подходом было последующее правильное расположение относительно друг друга секвенированных участков ДНК. Большое количество беспорядочно секвенируемых образцов, которые несли цепи ДНК в противоположных ориентациях, потребовало разработки специальных компьютерных профамм, позволяющих осуществлять такую стыковку как в ручном, так и в автоматическом режимах. Следует отметить, что особенно серьезные трудности возникали при состыковке секвенированных фрагментов ДНК, содержащих многочисленные повторяющиеся элементы. [c.241] Другой подход к получению случайных фрагментов ДНК для их последующего клонирования был осуществлен при помощи расщепления вставки ДНКазой I в присутствии ионов Мп2+ (рис. 8.5) [Anderson, 1981]. Известно, что при таких условиях ДНКаза образует разрывы обеих цепей ДНК, причем эти разрывы обычно расположены недалеко друг от друга. Применение этого фермента позволяло получать действительно случайный набор фрагментов ДНК, практически независящий от нуклеотидной последовательности. Таким образом, проведя подбор условий расщепления ДНКазой/ у1п2+, а затем, расфракционировав полученные фрагменты по размеру или ультрацентрифугированием в сахарозном градиенте или же гель-электрофорезом, можно было получить достаточно однородные фрагменты ДНК для создания на их основе субклонов. Однако концы таких фрагментов не были пригодны к лигированию, и требовалось их затупление, осуществляемое обычно с помощью Т4 ДНК-полимеразы. [c.242] Обработка фрагмента ДНК ультразвуком с целью его фрагментации, применяемая, пожалуй, чаще других воздействий, лишь незначительно зависит от особенностей его нуклеотидной последовательности, хотя и считается, что АТ-богатые участки ДНК расщепляются немного чаще, чем ОС-богатые. Размер получаемых под действием ультразвуковой обработки фрагментов ДНК зависит от продолжительности озвучивания, его амплитуды. Полученные таким образом фрагменты ДНК также нуждаются в репарации своих концов, протекающей достаточно эффективно, с целью их затупления и пригодности для клонирования в специально приготовленном векторе (рис. 8.6). Эффективное секвенирование субклонированных фрагментов предполагает предварительное обогащение пула озвученных молекул ДНК путем ультрацентрифугирования или гель-электрофореза. [c.243] Следует отметить, что все описанные выше способы получения субклонов требуют предварительного выделения вставки, так как в противном случае часть субклонов будет нести фрагменты не вставки. [c.243] Вернуться к основной статье