ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Гель-электрофорез из "Секвенирование ДНК" Определение последовательности нуклеотидов рассмотренными выше методами предполагает разделение продуктов секвенирующих реакций (как полученных в ходе ферментативного секвенирования, так и в процессе химической деградации) с помощью высоковольтного секвенирующего электрофореза в полиакриламидном геле. Сразу следует отметить, что этот метод претерпел целый ряд всевозможных улучшений и модификаций, направленных, главным образом, на повышение его разрешающей способности, рассмотрение которых и будет основной темой данной главы, поскольку сам принцип электрофореза детально изложен во многих обзорах и целых книгах и рассматривать его здесь, видимо, будет излишним. [c.168] Другой крайностью является использование миниатюрного ультра-тонкого (50 мкм) геля, заливаемого между предметными стеклами для микроскопа, размерами 25 х 75 мм [Stein et al., 1998], Электрофоретической камерой для такого геля служил обычный прибор для горизонтального агарозного электрофореза, время разделения в котором составляло около 6-7 мин. Несмотря на столь малые размеры геля авторам цитируемой работы при использовании в качестве метки радионуклида 35 удалось прочитать с рентгеновской пленки после 16-часовой экспозиции более 150 нуклеотидов. [c.171] Отсутствие промежутков между соседними матрицами ДНК, наносимыми в виде четырех реакций, как, например, G А Т С, при массовых анализах затрудняло визуальное выделение конкретного образца секвенируемой ДНК. Хотя проблема разграничения образцов ДНК в секвенирующем геле решается простым пропусканием одной дорожки между матрицами, но при этом теряется значительное число дорожек, что довольно неэкономно. Этот способ вполне возможен с обеими типами гребенок, однако гребенка типа зубы акулы в отличие от обычной позволяет сформировать промежуток между образцами ДНК, не оставляя между ними пустые дорожки. На протяжении многих лет нами использовался подход для формирования промежутков между образцами ДНК путем их последовательного нанесения через небольшой промежуток времени (обычно около 1 мин), за который фрагменты ДНК предыдущей матрицы под действием электрического тока уже успевали войти в сам гель. Этого оказывалось вполне достаточно, чтобы на заключительном радиоавтографе между соседними образцами ДНК была видна вертикальная полоса, хороша заметная на радиоавтографе, фрагмент которого приведен на рис. 4.3. [c.177] Такое последовательное нанесение образцов ДНК с попеременным подключением/отключением источника питания занимает несколько больше времени, чем обычное, но в то же время позволяет перед самым нанесением очередного образца промывать колодцы с целью удаления диффундирующей из геля мочевины, которая несколько мешает нанесению препаратов ДНК. И, во-вторых, как уже отмечалось выше, на заключительном радиоавтографе отдельные матрицы ДНК хорошо заметны в виде четверок дорожек, принадлежащих одному образцу. Более скоростной вариант подобного нанесения, приводящего к формированию промежутков между образцами ДНК, был предложен Нельсоном и Кравецом [Nelson, Krawetz, 1994]. Главное отличие предложенного ими подхода заключалось в нанесении в первый заход нечетных матриц (1, 3, 5 и так далее) в соответствующие дорожки (1,2,3,4 9,10,11,12 17,18,19,20 и так далее), после чего на 5 мин подавалось рабочее напряжение. А во втором заходе наносились четные матрицы (2, 4, 6 и так далее) в оставшиеся пустыми соответствующие дорожки геля. В результате на заключительном радиоавтографе были видны те же вертикальные светлые полоски, разделяющие соседние образцы ДНК. [c.177] Нельзя не упомянуть о недавно предложенной уникальной гребенке, позволяющей осуществить одновременное быстрое, занимающее всего несколько минут, нанесение 200 образцов на полиакриламидный гель шириной 30 см [Erfle et al., 1997]. Эффективность данной гребенки была продемонстрирована при автоматическом секвенировании ДНК в двух различных приборах, хотя авторы утверждают о возможности ее применения как для вертикальных, так и горизонтальных гелей ультра-тонкой и стандартной толщины. Особенностью этой гребенки является то, что она изготовлена из пористого материала и поэтому образцы ДНК предварительно наносятся на каждый зубец гребенки, впитываются в него и уже затем гребенка с препаратами ДНК, находящимися в зубьях, втыкается в гель. Под действием электрического тока препараты ДНК выходят из гребенки и входят в полиакриламидный гель. [c.179] Возвращаясь к порядку нанесения образца ДНК на секвенирующий гель, стоит обратить внимание на последовательность расположения различных типов реакций. Так, при секвенировании ДНК методом химической деградации, его классическим вариантом, в первой дорожке обычно разделяются продукты G-реакции, во второй - G + А, в третьей - С + Т ив четвертой - С. Данная последовательность является палиндромом (GRY ), поэтому в случае необходимости чтения противоположной цепи ДНК можно просто повернуть радиоавтограф вокруг своей вертикальной оси на 180° и таким образом читать комплементарную цепь. Конечно, последовательность комплементарной цепи можно потом легко получить с помощью компьютера, однако на стадии чтения различных субклонов, в случае если их последовательности принадлежат разным цепям, это имеет некоторый смысл. Однако существуют некие правила чтения тех или иных нуклеотидов в связи с их окружением и поэтому такое комплементарное чтение не тех нуклеотидов может привести к увеличению числа ошибок. [c.180] Для проведения секвенирующего гель-электрофореза фрагментов ДНК, кроме специально изготовленной камеры, которая может быть весьма простой и способной только поддерживать стекла с залитым между ними гелем, даже не обеспечивая при этом отвод выделяющегося в процессе электрофореза тепла, необходим высоковольтный источник питания. Для эффективного разделения в полиакриламидном секвенирующем геле фрагментов ДНК подаваемое напряжение должно быть в пределах от 30 до 50 В на см длины геля и, учитывая его большой размер, источник питания должен обеспечивать стабилизацию напряжения не менее 2000 В. Для более эффективного разделения фрагментов ДНК и повышения общей производительности метода можно порекомендовать приобретение фабрично изготовленного прибора, в котором предусмотрено и определенное удобство заливки геля и дальнейшего обращения с ним, и равномерное распределение Джоулева тепла во время электрофореза, и комплект запасных спейсеров и гребешков. Выбор подобных аппаратов, включая автоматические секвенаторы ДНК, достаточно велик, но и их стоимость весьма существенна. Однако следует отметить, что для осуществления небольших проектов секвенирования ДНК не обязательно приобретать дорогостоящие автоматические секвенаторы (хотя в последнее время появились относительно недорогие модели, о которых речь пойдет в главе, посвященной автоматическому секвенированию ДНК). [c.181] Вернуться к основной статье