ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы БИОЛОГИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ из "Биосенсоры основы и приложения" Поскольку сама жизнь зависит от непостижимо сбалансированного специфического переноса электронов между ферментами и субстратами, вряд ли удивительно, что средства контроля жизненных биохимических клеточных процессов могут включать сенсоры, состоящие из тех же веществ, которые участвуют в этих процессах. Как и в прошлом, прогресс в этой области определяется углубленным пониманием механизмов функционирования ферментов, возможным синтезом ферментов, более точным контролем переноса электронов, тесным взаимодействием между электрохимией и физиологией живых систем. [c.11] Важнейшей вехой в развитии биохимии было открытие братьями Бухнерами процесса брожения в фильтрате дрожжевых клеток, оболочки которых были разрушены растиранием с песком. Вслед за тем в 1926 г. Самнер сумел получить кристаллическую уреазу и таким образом показал, что ферменты имеют явно белковую природу. Для этого магическая роль ферментов предположительно сводилась к их органическому вплетению в жизненный процесс. Большинство исследователей полагало, что с ферментами следует обращаться как со скоропортящимися продуктами, такими, как свежие яйца, и перед измерениями или использованием их следует хранить на холоде. [c.11] Рассматривая ферменты как специфические химические преобразователи, переводящие определяемое вещество в форму, детектируемую физическими или химическими методами, удалось придумать и разработать новый класс сенсоров, для которых характерна чувствительность к биологическим соединениям. Перспективным путем повышения селективности и чувствительности и расширения возможностей этих устройств является комбинирование различных ферментов, например эстераз, дегидрогеназ и оксидаз с детекторами-полярографическими, кондуктометрическими, потенциометрическими, акустическими и оптическими. Б первых ферментных электродах ферменты физически удерживались на поверхности сенсора или в непосредственной близости от нее. Позже были предложены методы химической иммобилизации, осаждения и другие. Коферменты также физически или химически закрепляются на поверхности сенсора. Перевод фермента в нерастворимую форму как способ увеличения его времени жизни позволяют избежать осложнений, связанных с осмотическими явлениями в коллоидных растворах, особенно когда в ферментном электроде используется проницаемая для определяемого компонента мембрана В идеальном случае ферментный биосенсор должен работать непосредственно в неразбавленной цельной крови, подобно газовым и рН-электродам, в свое время произведшим революцию в анализе. [c.11] На катоде, как правило, происходит необратимое восстановление кислорода, а на аноде-необратимое окисление субстрата, например пероксида водорода или аскорбиновой кислоты. В отличие от оптических методов, в полярографии, как показал Гейровский, приложенный потенциал определяет химизм протекающих процессов, а сила тока характеризует их количественно. Таким образом, давление и поток электронов позволяет соответственно контролировать и измерять протекающие в системе процессы. [c.14] О биосенсорах, т. е. сенсорах, включающих биологический материал (рис. 1.4), впервые сообщалось на симпозиуме New York A ademy of S ien es в 1962 г. [6]. В этом сообщении было предложено использовать ферментные преобразователи, встроенные в мембраны (так, что получается подобие сандвича), чтобы сделать электрохимические сенсоры (pH, полярографические, потенциометрические или кондуктометрические) более совершенными. В результате получились сенсоры, специфически чувствительные к определенным субстратам, поскольку они детектировали образование продукта ферментативной реакции или расход одного из участвующих в этой реакции веществ. Описана, в частности, комбинация глюкозооксидазы с Ог-электродом Кларка для определения глюкозы по убыли содержания кислорода при превращении глюкозы в глюконовую кислоту и пероксид водорода. [c.14] Если обратить полярность классического амперометрического кислородного электрода и превратить его в анод с положительным потенциалом около 0,6 В, то он становится совершенно нечувствителен к кислороду, но зато дает отклик на пероксид водорода, который окисляется до воды. На платиновом аноде окисляется также аскорбиновая кислота, однако лишь немногие другие вещества присутствуют в физиологических жидкостях в количествах, достаточных чтобы влиять на ток в области, соответствующей катодному току кислородного электрода. Чувствительность этого анода к пероксиду водорода казалась привлекательной, но поскольку каталаза имеется почти всюду, биосенсор для определения пероксида водорода не представляет особой ценности, за исключением случаев измерения активности каталазы или пероксидазы. Поэтому считалось, что белки только загрязняют поверхность платины. Так, первое в моей практике использование платинового катода было связано с настоятельной необходимостью удержать белки и клетки крови вдали от поверхности платины. Думаю, что размышления о том, как уберечь платиновый анод от каталазы, и привели меня к идее использовать одну и ту же мембрану для того, чтобы одновременно удерживать каталазу вдали, а другие ферменты (все они представляют собой белки с большими молекулами) вблизи платины. В первом ферментном электроде фермент помещался, как начинка сандвича, между двумя мембранами, поскольку все еще опасались загрязнения поверхности платины белками и коферментами. Но я также добавлял фермент непосредственно в электролит между анодом и катодом, и электрод хорошо работал при определении глюкозы. [c.15] Один из способов решения проблемы полярографически активных веществ, содержащихся в анализируемом образце, заключается в конструировании мембран, которые предотвращают попадание нежелательных веществ на поверхность платины. Для этого необходимо две мембраны, одна из которых, внутренняя, исключает проникновение любого нежелательного вещества, а другая - внешняя, обеспечивает прохождение субстрата (а также обычно и мешающего вещества) в ферментный слой. Разработано множество комбинаций таких мембран и несколько из них имеется в продаже. Например, в глюкозном и лактатном электродах фирмы 81 используются комбинации ацетилцеллюлозных и поликарбонатных мембран Кис1ероге. [c.16] Переход в полярографии от первых двухэлектродных систем к трехэлектродной, импульсной, дифференциальной импульсной и т.д. полярографии повысил чувствительность и точность этого метода. Важно помнить, что в различных схемах приложений к электроду потенциал влияет не только на протекающие на его поверхности электрохимические процессы, но и на состояние и активность используемого фермента. Новые пути к повышению чувствительности ферментных сенсоров открывает способ усиления сигнала путем циклического использования фермента [22]. [c.16] Из множества субстратов, определяемых с помощью кислородных оксидоредуктаз, отметим глюкозу, лактат, пируват, галактозу, спирт, холестерин, глицерин, гипоксантин, ксантин, оксалат и фруктозу. Следует упомянуть остроумное использование ферроцена в качестве медиатора переноса электрона в сенсоре на основе оксидазы при определении глюкозы [2] (см. также гл. 15 и 16). [c.16] Ежегодно в примитивных формах жизни, например грибах, находят все новые кислородные оксидоредуктазы, но еще больше обнаруживается дегидрогеназ, обычно у высших растений и животных. В работе [21] предложен сенсор для определения лактата, в котором пара ферроцианид/феррицианид сопрягается с лактатдегидро-геназой. [c.16] С помощью биосенсоров можно также измерять активность большого числа ферментов в крови. Измерение активности ферментов, связанных с сердечной деятельностью (таких, как аспартатаминотрансфераза, креатинкиназа, креатинкиназа МВ), позволяет оценить глубину инфаркта в клинических условиях. Наряду с определением концентрации лактата и глюкозы измерения активности этих ферментов в стационаре представляют определенную ценность при назначении терапевтического лечения больных с потенциально летальной аритмией в предгоспитальной фазе острого инфаркта миокарда. Стационарные измерения активности амилазы могут быть ценны в педиатрии. [c.16] Служба, обеспечивающая быстрое определение глюкозы, должна стать частью любого педиатрического учреждения. Проводимое круглосуточное определение глюкозы наряду с другими мерами может защитить детей от опасной гипогликемии перед хирургической операцией. Необходимо также обеспечить определение лактата и, возможно, пирувата. Врачи и младший медицинский персонал педиатрических учреждений должны быть обучены градуировке биосенсорной аппаратуры, с тем чтобы определять глюкозу и лактат в одно и то же время или в тех же образцах крови, что и газовый состав и pH. [c.16] Различные комбинации мембран на основе антител и ферментных электродов могут привести к созданию новых автоматизированных сенсоров, чувствительных к антигенам. Такие биосенсоры, возможно сопряженные с сенсорами ферментов печени, позволяют обеспечить быстрое и надежное наблюдение за кровеснабжением. На рис. 1.6 показан иммуносенсор на основе измерения потребления кислорода в присутствии глюкозооксидазы и глюкозы. Таким образом определяют содержание антител поверхностного антигена вируса гепатита В. Описаны и другие электроферментные методы для иммунологических исследований, и это направление, видимо, будет интенсивно развиваться (гл. 14). [c.18] Ферментные электроды вполне пригодны для медицинских учреждений и для контроля в домашних условиях, поскольку их можно легко выпускать массовыми партиями из относительно недорогих и стабильных компонентов. Могут быть разработаны и недорогие приборы для определения алкоголя в крови, возможно, даже через кожу. Особенно нуждаются в биосенсорах службы срочной медицинской помощи, где срочно выполненный анализ может спасти жизнь пациента. [c.18] вероятно, наибольшие перспективы имеет использование ферментных электродов как биосенсоров внутри или на поверхности живою организма. Сенсоры, например, лактата и глюкозы исключительно малого размера можно помещать во внутрисосудистые катеторы для контроля состояния тяжелобольных пациентов [5, 10]. Трудно переоценить важность такого показателя, как концентрация лактата в крови, который является мерой степени оксигенации ткани или сердечной деятельности. Имеются также данные, что высокое содержание лактата в материнском молоке во время работы матери может вредно действовать на новорожденного. Гипоксантин может оказаться ценным индикатором гипоксии. Имплантируемые сенсоры глюкозы почти наверняка можно приспособить для контроля работы инсулиновых насосов [10]. Уже одно только использование ферментных электродов при диагностировании и лечении диабета оправдывает огромные усилия по объединению энзимологии с электрохимией. [c.18] Биохимические и микробиохимические процессы все шире применяются в фармацевтической и пищевой промышленности, очистке сточных вод и энергетике. Очень важную роль в биотехнологических процессах играет брожение. Поэтому контроль сырья, клеточной популяции и конечных продуктов - необходимое условие обеспечения эффективности всей системы. Для определения органических соединений можно использовать спектрофотометрию и хроматографию, однако эти методы непригодны для непрерывных измерений в режиме на линии (on-line). Электрохимическое определение таких соединений имеет явные преимущества так, можно проводить измерения без предварительной подготовки проб и, кроме того, не требуется их оптическая прозрачность. В последние годы разработано множество биосенсоров для определения органических соединений. Многие ферментные сенсоры обладают высокой специфичностью по отношению к представляющим интерес субстратам, однако используемые в них ферменты обычно дороги и неустойчивы. Микробные сенсоры состоят из иммобилизированных микроорганизмов и какого-либо электрохимического датчика и пригодны для непрерывного контроля биохимических процессов [1-3, 19, 20]. Принцип работы предложенных автором этой главы микробных сенсоров-это ассимиляция органических соединений микроорганизмами, что непосредственно регистрируется электрохимическим датчиком. В данной главе описано несколько микробных сенсоров, разрабатываемых в Японии. [c.20] При культивации микроорганизмов на патоке сахарного тростника, содержащей различные сахара, для контроля процесса брожения важно определение суммарного содержания усваиваемых сахаров в среде. Так, при высокой концентрации сахара наблюдается подавление катаболизма, что приводит к подавлению роста клеток. Восстановленные сахара и сахарозу в культуральных средах можно определять феррицианидным методом [21]. Этот метод, однако, не вполне надежен, поско,льку неусваиваемые сахара могут мешать определению. [c.20] Вернуться к основной статье