ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Осаждение белков органическими растворителями из "Методы очистки белков" Добавление к водному экстракту, содержащему белки, таких растворителей, как этанол или ацетон, вызывает различные эффекты, которые вместе приводят к осаждению белка. Основной эффект заключается в снижении активности воды. По мере возрастания концентрации органических растворителей снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента. Это можно объяснить снижением диэлектрической постоянной растворителя или же просто вытеснением большой массы воды и частичной иммобилизацией ее молекул вследствие гидратации молекул органического растворителя. Молекулы воды, расположенные упорядоченным образом вокруг гидрофобных участков на поверхности белка, могут быть замещены молекулами органического растворителя, что приводит к относительно более высокой растворимости этих участков. Некоторые сильно гидрофобные белки (обычно мембранные) могут растворяться в 100%-ном органическом растворителе. Однако суммарное действие органических растворителей ка цитоплазматические и другие водорастворимые белки состоит в снижении их растворимости до уровня, при котором начинаются агрегация и осаждение. [c.73] Основная причина агрегации белков заключается, вероятно, в электростатических и вандерваальсовых силах, сходных с силами, действующими при высаливании белков в отсутствие органического растворителя. Гидрофобные взаимодействия имеют здесь меньшее значение из-за солюбилизирующего влияния органических растворителей на неполярные участки белковой глобулы. Было установлено, что вблизи изоэлектрической точки белков осаждение происходит при более низкой концентрации органического растворителя. Это подтверждает предположение о том, что агрегация, происходящая в данном случае, сходна с агрегацией, наблюдающейся при изоэлектрическом осаждении белков. На рис. 3.9 схематически изображены молекулы белков в смеси воды с органическим растворителем агрегация здесь происходит за счет взаимодействий между противоположно заряженными участками на поверхности белков. [c.74] Одно из преимуществ фракционирования с помощью органических растворителей заключается в том, что его можно проводить при. температуре ниже нуля, так как все смешивающиеся с водой растворители образуют смеси, замерзающие при температуре значительно ниже 0 С. Это очень важное свойство, так как в ходе фракционирования необходимо поддерживать низкую температуру. При температуре выше -ЫО°С становится заметным денатурирующее действие органического растворителя. Денатурация связана с изменением молекулярных гидрофобных взаимодействий, стабилизирующих структуру белка. Отсутствие денатурации при низкой температуре обусловлено малой вероятностью того, что молекулы органического растворителя проникают во внутренние участки белковой глобулы и дестабилизируют ее. При более высоких температурах небольшие молекулы органических веществ проникают в поверхностные трещины , образующиеся спонтанно в результате естественной подвижности структуры, и связываются за счет гидрофобных взаимодействий с внутриглобулярными остатками, такими, как Leu, Пе, Туг, Phe, Val и т.д. (рис. 3.12). С повышением температуры внутренние гидрофобные взаимодействия в белковой молекуле усиливаются и начинают играть относительно более важную роль в поддержании целостности молекулы. Все это ведет к автокаталитической денатурации. [c.76] Некоторые органические растворители проявляют более сильное денатурирующее действие, чем другие. Давно установлено, что спирты с длинной цепью обладают более высокой денатурирующей способностью по сравнению с короткоцепочечными спиртами. Примеры этого приведены в разд. 3.5. Хотя этанол и используется в стандартных методах фракционирования белков плазмы [30], необходимо отметить, что эти белки (лишь немногие из них относятся к ферментам) составляют группу, характеризующуюся необычной стабильностью и переносящую условия, в которых денатурируют более чувствительные белки. Ацетон обладает менее денатурирующим действием, чем этанол, отчасти потому, что при низкой температуре требуются несколько более низкие его концентрации, чтобы получить такое же осаждение, как и при использовании этанола. Он также более летуч, что позволяет легко удалять его из растворенного осадка при пониженном давлении. [c.76] После добавления первой порции растворителя (ацетона или этанола), обычно до 20—30%-ной концентрации, необходимо строго поддерживать соответствующую для данного случая температуру (например, О С) в течение 10—15 мин, прежде чем проводить центрифугирование в предварительно охлажденном роторе. Количество осадка в значительной степени зависит от температуры, увеличиваясь при более низкой температуре. (Редкое исключение из естественного закона подлости , который гласит, что стоит что-либо одно изменить, как что-то другое тут же изменится к худшему. Снижение температуры не только уменьшает возможность денатурации, но и позволяет использовать более низкие концентрации органического растворителя.) Так как очень трудно точно поддерживать температуру ниже 0°С, особенно во время центрифугирования, на практике для осаждения белков органическими растворителями обычно используют температуру 0°С 1°С. [c.78] После уравновешивания смеси при данной концентрации растворителя и определенной температуре в течение 10—15 мин осадок можно отделить центрифугированием. Плотность большинства органических растворителей, смешиваемых с водой, ниже плотности воды, поэтому седиментация агрегированного белка происходит очень быстро. При высокой концентрации растворителя и больших объемах смеси седиментация при 1 д (т. е. при стоянии) может быть достаточно быстрой, что позволяет декантировать большую часть надосадочной жидкости, не прибегая к центрифугированию. Однако обычно центрифугирование необходимо. Для этого вполне пригодны центрифуги большой емкости, создающ,ие ускорение всего в несколько тысяч д, при условии что они имеют охлаждение. Не лишним будет еще раз подчеркнуть, что для получения воспроизводимых результатов необходимо поддерживать постоянную температуру как перед центрифугированием, так и во время него. [c.79] Далее осадок снова растворяют в холодном буфере подходящего состава. Если при диспергировании осадка не получается прозрачного раствора, не стоит добавлять избыток буфера — вероятно, в растворе есть денатурированный белок. Обычно легче диспергировать белковый осадок в небольшом объеме. [c.79] Использование объема буфера, превышающего объем осадка в два раза, позволяет вдвое снизить концентрацию органического растворителя в результате должен получиться раствор, содержащий весь неденатурированный белок. Если же раствор сильно разведен, его трудно сконцентрировать вновь. Кроме того, если излишки органического растворителя удаляют выпариванием, то чем выше его исходная концентрация, тем быстрее он испаряется. [c.79] В приложении А (табл. II) приведены количества чистого растворителя, которые следует добавить для получения растворов с различной концентрацией растворителя. [c.80] ЦИИ 23% по объему и удаляли осадок значение pH надосадоч-ной жидкости при этом оказалось равным 6,4. [c.81] Неоднократно подчеркивалось, что если при фракционировании органическими растворителями температура слишком высока, то может произойти денатурация белка. Однако эта дена турация носит избирательный характер. Некоторые ферменты отличаются удивительной стабильностью. В частности, внекле-точные белки, а также ферменты термофильных организмов должны быть более устойчивыми, что объясняется условиями их природного окружения. Такие белки выдерживают воздействие органических растворителей при повышенной температуре. Использование органических растворителей для избирательной денатурации обсуждается далее в разд. 3.6. [c.81] Вернуться к основной статье