ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Высаливание при высокой концентрации соли из "Методы очистки белков" В этом разделе описан один из наиболее широко применяемых способов очистки ферментов —высаливание белков при высокой концентрации солей. Этот способ отличается по своему результату от всаливания , описанного в разд. 3.2. Хотя белки типа глобулинов (т. е. белки, растворимость которых низка при низкой ионной силе вблизи их изоэлектрической точки) обычно характеризуются также относительно низкой растворимостью и при высокой концентрации соли, из этого правила есть много исключений. Так, сывороточные у глобулины, типичные белки, нерастворимые при низкой солевой концентрации, осаждаются сульфатом аммония (при относительно низкой его концентрации— около 1,5 М). С другой стороны, некоторые другие сывороточные глобулины (а и р) обладают более высокой растворимостью в сульфате аммония и осаждаются им при концентрации около 2,5—3,0 М. Процесс высаливания в основном зависит от гидрофобности белка, тогда как всаливание в большей степени определяется распределением зарядов на поверхности белковой глобулы и полярными взаимодействиями ее с растворителем. [c.61] В растворе типичная белковая молекула имеет гидрофобные участки (боковые цепи Phe, Туг, Тгр, Leu, Пе, Met и Val).. [c.61] Упорядоченное расположение молекул воды вокруг гидрофобных остатков на поверхности белка. [c.62] Их соприкосновение с водным растворителем приводит к упорядочению структуры воды, которая как бы замораживается вокруг боковых цепей аминокислотных остатков (рис. 3.5) [25]. Такое упорядочение структуры термодинамически неус тойчиво, так как в подобной системе происходит значительное снижение энтропии по сравнению с системой негидратирован-ный белок —свободные молекулы воды. [c.62] Агрегация, описанная уравнением (3.2), наблюдается во всех случаях, когда белок освобождается от достаточного количества воды. Следует отметить, что Д// этой реакции положительна. В результате, согласно уравнению Аррениуса, агрегация, обусловленная гидрофобными взаимодействиями, усиливается с увеличением температуры. Это известная особенность гидрофобных взаимодействий. Осаждение белков при добавлении солей в большинстве случаев характеризуется положительным значением ДЯ°, так как при данной концентрации соли повышение температуры вызывает образование большего количества осадка. [c.63] Агрегацию гидрофобных участков на поверхности белка при высокой концентрации соли можно описать иными словами по мере того как происходит сольватация ионов соли и свободных молекул воды остается мало, возрастает тенденция к отрыву упорядоченных замороженных молекул воды от гидрофобных боковых цепей с обнажением неполярных участков, которые стремятся взаимодействовать друг с другом. Белки, содержащие на поверхности молекул большое число или скопления гидрофобных аминокислотных остатков, агрегируют быстрее, тогда как белки с незначительным содержанием неполярных остатков на поверхности остаются в растворе даже при самых высоких концентрациях соли. Существуют и другие, более сложные интерпретации действия соли на растворимость белка, оперирующие понятиями свободной энергии. Эффективность действия различных солей коррелирует также с увеличением молярного поверхностного натяжения за счет соли, содержащейся в растворителе [26]. [c.63] Источник данных неопубликованные наблюдения автора. [c.65] Хотя высаливание в значительной мере определяется гидрофобными взаимодействиями, другие параметры также влияют на растворимость белков. Так, растворимость может изменяться при изменении pH потеря заряда снижает полярность поверхности белка. Обычно самую высокую растворимость в солевых растворах белки имеют при pH 7, когда они содержат наибольшее число заряженных групп. С другой стороны, агрегация происходит легче вблизи изоэлектрической точки белка. Классический пример такой агрегации представляет одностадийная очистка глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.12) из мышц кролика [27]. При pH 6 этот фермент растворим в 3,2 М сульфате аммония, но выпадает в осадок при pH 7,5 или выше, причем он может быть получен в кристаллическом виде даже из грубого экстракта. Его изоэлектрическая точка (по крайней мере при низкой концентрации соли) лежит при pH около 8,5. [c.65] Температура оказывает необычное действие на растворимость белков при высокой концентрации соли из-за того, что, как было сказано выше, она влияет на гидрофобные взаимодействия. В области высаливания растворимость белков обычно снижается с повышением температуры. Мутный белковый раствор, приготовленный для кристаллизации при комнатной температуре (разд. 9.3), часто становится абсолютно прозрачным при температуре 4 С. [c.65] При выборе соли необходимо учитывать стоимость килограммовых количеств достаточно чистого препарата, растворимость (нужны растворы высокой концентрации), а также особенности, связанные с нагреванием раствора. Нежелательно нагревать раствор во время растворения соли. Кроме того, большая величина ДЯ раствора свидетельствует о значительных изменениях растворимости в зависимости от температуры. Наконец, важное значение имеет плотность концентрированного раствора, так как эффективность центрифугирования при отделении осадка определяется разностью между плотностью белкового осадка и плотностью растворителя. [c.66] Растворимость сульфата аммония очень мало меняется в области температур от О до 30°С концентрация насыщенного раствора в воде составляет приблизительно 4 М. Плотность этого насыщенного раствора равна 1,235 г-см з, а плотность белкового агрегата в таком растворе—1,29 г-см- (разд. 1.2). Раствор 3 М фосфата калия при pH 7,4 имеет плотность 1,33 г-см Так как белковый осадок в этом растворе обладает такой же плотностью, его невозможно отделить центрифугиро- ванием. Однако отделение осадка можно осуществить с помощью фильтрации или же путем адсорбции на амфифильном носителе, например агарозе (разд. 4.8). Осаждение белков 3—4 М сульфатом аммония иногда также может быть затруднено из-за избыточной плотности, создаваемой присутствием в грубых экстрактах других солей и компонентов. [c.67] Сульфат аммония доступен в достаточно чистом виде и довольно дешев даже при использовании его в больших количествах. Однако незначительное загрязнение тяжелыми металлами, особенно железом, может повредить чувствительные к ним ферменты. Перед осаждением белков солями аммония необходимо добавить в раствор какие-либо металлсвязывающие агенты, например ЭДТА. Важно отметить, что даже в том случае, когда содержание тяжелого металла в препарате соли составляет всего лишь одну часть на миллион, концентрация его биохимически активной формы в 3 М растворе сульфата аммония будет равна нескольким мкМ. Количество сульфата аммония, которое нужно добавить для получения необходимой концентрации, можно подсчитать с помощью простой формулы (уравнение 3.5а). Эта формула учитывает увеличение объема при добавлении соли. Так, хотя растворимость сульфата аммония составляет 533 г-л при 20°С, для получения насыщенного раствора к 1 л нужно добавить 761 г соли. Объем такого раствора будет равен 1,425 л, а его плотность составит 1761/1425=1,235 г-см . Концентрацию сульфата аммония обычно выражают в процентах насыщения, допуская, что обрабатываемый раствор эквивалентен воде по способности растворять сульфат аммония. Для этого используют уравнение (3.56). [c.67] Обе эти формулы основаны на допущении, что раствор 100%-ного насыщения соответствует 4,05 М раствору. Следует отметить, чхо на практике из-за присутствия в растворе других солей и белка истинная растворимость сульфата аммония в образце будет несколько меньше, чем 533 г-л при 20°С. Количество необходимого сульфата аммония можно найти в приложении А в таблице I, где оно дано с интервалом в 5%. Значения для других степеней насыщения можно получить исходя из этих цифр путем интерполяции. Значение pH может быть важным при осаждении, однако в большинстве случаев при незначительном изменении pH от эксперимента к эксперименту разница оказывается несущественной. Лучше всего работать при нейтральных значениях pH (6—7,5). Сульфат аммония обладает слабым подкисляющим действием, поэтому раствор должен содержать буфер (например, фосфатный) примерно 50 мМ концентрации. [c.68] Фракционирование сульфатом аммония имеет одно важное преимущество по сравнению практически со всеми другими методами — оно приводит к стабилизации белков. Суспензия белкового осадка или кристаллов в 2—3 М растворе сульфата аммония стабильна в течение многих лет. Это обычный метод хранения коммерческих ферментов. Высокая концентрация соли предотвращает также протеолиз и действие бактерий (разд. 6.2). В процессе очистки всегда бывает полезно иметь стадию, на которой образец можно оставить на ночь. Такой стадией может быть получение осадка в растворе сульфата аммония, как от-центрифугированного, так и неотцентрифугированного, хотя в некоторых случаях образец лучше хранить замороженным. [c.69] Вновь растворенный осадок содержит значительные количества сульфата аммония, который необходимо удалить перед следующей стадией очистки. Для этого обычно используют такие методы, как диализ или гель-фильтрация на обессоливающей колонке (разд. 1.4). Активность фермента можно определить в растворенном осадке или надосадочной жидкости, но в последнем случае нужно быть уверенным, что количество сульфата аммония, добавленное в определяемую смесь вместе с образцом, не скажется на результатах. [c.71] Определение активности в осадке нужно проводить в любом случае. Хотя потери при фракционировании сульфатом аммония обычно невелики, активность, содержащаяся в осадке, может быть меньше, чем разность между активностями в двух последовательно полученных надосадочных жидкостях. [c.71] Вместо растворения твердой соли в образце в него можно добавлять нужное количество насыщенного раствора так же, как это делается при добавлении органических растворителей (разд. 3.4). Такой прием особенно полезен, если фермент полностью осаждается при 50%-ном насыщении, так как при этом объем возрастает только в два раза. При работе в больших масштабах добавление сульфата аммония в виде раствора неприемлемо, но для выделения белков в малых количествах это вполне подходящий метод. При более высоком проценте насыщения объем раствора увеличивается еще больше, а происходящее при этом разбавление белка в свою очередь требует еще более высокой степени насыщения, чтобы осаждение было столь же эффективным. Поэтому данный метод не рекомендуется использовать при степени насыщения выше 50%. [c.71] Очень важно помнить, что соль никогда не осаждает фермент полностью, а только снижает его растворимость. Если исходная смесь содержит, скажем, 1 мг-мл нужного фермента, то снижение растворимости до 0,1 мг мл означает 90%-ное осаждение фермента. Это достаточно высокий выход. С другой стороны, если исходная концентрация фермента составляет только 0,1 мг-мл-, то при той же концентрации соли осаждения фермента не произойдет. Другими словами, область концентрации соли, осаждающей фермент, зависит не только от свойств самого фермента, но и от свойств других белков, присутствующих в растворе (соосаждение), а также от концентрации белка в исходном растворе. [c.71] Наконец, очень важно применение высаливания не столько для фракционирования образцов, сколько для их концентрирования. Может возникнуть необходимость в концентрировании элюата, полученного с ионообменной колонки или после гель-фильтрации. Высаливание при добс влении необходимого количества сульфата аммония для осаждения всех белков является эффективным способом концентрирования — при условии, что образец, который нужно сконцентрировать, не слишком разбавлен. Для получения раствора приблизительно 85%-ного насы-ш ения удобно растворить 60 г сульфата аммония в 100 мл. При такой концентрации сульфата аммония немногие белки имеют растворимость выше 0,1 мг-мл Но если исходная концентрация белка в растворе ниже 1 мг-мл , то перед высаливанием следует попытаться повысить ее, например с помощью ультрафильтрации (разд. 1.4). [c.72] Вернуться к основной статье