ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Опасность образования слоя чистой воды из "Исследование биологических макромолекул методами" РО ) можно снизить до 10—20 мМ, т. е. уменьшить в 50— 100 раз по сравнению с той, которую используют для горизонтальных пластин, поскольку объем электролита, приходящийся на единицу площади сечения геля в трубке, во много раз больше, чем для пластины, где весь этот объем ограничен жидкостью, пропитывающей полоску фильтровальной бумаги. Нередко в качестве католитов используют разбавленные растворы этилендиамина, этаноламина и триэтиламина. Как и для пластин, при использовании градиентов pH, сдвинутых в сторону от нейтральной области, в качестве одного из электролитов часто берут смесь нейтральных амфолитов, чтобы избежать опасности образования слоя чистой воды. [c.40] Выбор знака верхнего электрода связан с тем, что белковый препарат вносят на гель сверху. При этом следует учесть как соображения устойчивости белка при кислых или щелочных значениях pH амфолитов, располагающихся по концам градиента, так и желательность максимального начального заряда белка для увеличения скорости его миграции в геле. Степень устойчивости белка к экстремальным значениям pH может диктовать и момент внесения препарата. Если белок вносят после предварительного фокусирования амфолитов, то он быстрее достигнет своего равновесного положения. Это может иметь первостепенное значение для сохранения биологической активности, если только миграция через область pH конца градиента не представляет для данного белка опасности. В противном случае белковый препарат приходится наносить на гель до начала ИЭФ, когда смесь амфолитов еще имеет среднее значение pH. [c.40] Разбавленные белковые растворы можно наносить на гель порциями, одну за другой. О завершении перехода белков в гель можно ориентировочно судить по проникновению в него следовых количеств красителя бромфенолового синего, который в этом случае подмешивают к препарату (если его вносят с катодного конца градиента). Количество белка берут обычно из расчета 1—10 мкг на сфокусированную зону. Такое количество надежно обнаруживается окрашиванием. Если далее предполагают фракционировать белки во втором направлении, то загрузку следует увеличить. Ее предельная величина зависит от растворимости белка в изоэлектрической точке. О способах ее увеличения сказано ниже. Для ориентировки можно считать, что 50 мкг белка в полосе — верхний предел загрузки ПААГ при ИЭФ в трубках диаметром 3 мм. [c.40] Для измерения истинного распределения pH вдоль градиента в цилиндрике геля, извлеченном из трубки, приходится разрезать гель на короткие участки одинаковой длины и элюировать амфолиты из них водой или (лучше) 0,01 М раствором хлористого калия. Во избежание чрезмерного разбавления амфолн тов объем элюата не должен более чем в 5 раз превышать объем геля. При этом следует избегать закисления раствора в щелочной области градиента за счет поглощения углекислого газа из атмосферы, для чего необходимо измерять pH немедленно после элюции, а элюирующую жидкость предварительно прокипятить. Можно пользоваться и торцевыми электродами для измерения pH непосредственно в геле после его извлечения из трубки. [c.41] Для окрашивания белков в цилиндриках геля используют те же приемы, что и для пластин. Окрашенные гели иногда ден-ситометрнруют с помощью сканирующих устройств, которыми оборудованы многие современные спектрофотометры. Об ограничениях метода денситометрирования окрашенных белковых полос для оценки содержания в них белков подробно сказано в первой книге [Остерман, 1981]. [c.41] Авторы определили следущие значения р1 для пяти главных гистонов 8,9 для Н1, 9,8 для НЗ, 9,9 для Н2В, 10,1 для Н2А и 10,25 для Н4. Всего было обнаружено 12 полос главных гистонов и субфракций. На рис. 12 картина ИЭФ гистонов сопоставлена с их электрофореграммой в ПААГ. Преимущества ИЭФ в отношении качества фракционирования очевидны. [c.42] Уже упоминалось, что эффект эндосмоса снижается при увеличении вязкости пронизывающей гель жидкости. В гелях агарозы для этой цели обычно используют сорбит в концентрации 10— 2%. Его растворяют в воде, затем насыпают на поверхность раствора сухую агарозу, дают ей набухнуть и осесть и, как обычно, нагревают раствор на кипящей водяной бане до тех пор, пока не прекратится выделение пузырей воздуха, что свидетельствует о полном растворении агарозы. Колба с раствором при этом должна быть хорошо закрыта. Амфолиты виосят перед заливкой, после охлаждения раствора до 60—70°. [c.43] ИЭФ в первом направлении проводили в трубках длиной 13 см с внутренним диаметром 2,5 мм. 4%-ный ПААГ (С=2,б) полимеризовали в 9,5 М растворе мочевины с добавлением 2% неионного детергента NP-40 (Nonidet Р-40). Амфолины ( LKB ) в этот раствор вносили до суммарной концентрации 2% (масса/объем), причем 1,6% составляли амфолины диапазона pH 5—7 и 0,4%—pH 3—10. Инициаторные добавки вводили в относительно малых количествах 0,01% персульфата аммония и 0,07% ТЕМЭД. Полимеризация геля занимала 2—4 ч. При этом сначала на гель наслаивали 8 М раствор мочевины, затем его заменяли указанной выше смесью 9,5 М мочевины и 2% NP-40 с добавлением 5% -меркаптоэтанола. [c.45] Во втором направлении белки разделяли ступенчатым электрофорезом в пластине ПААГ размером 13X14 см и толщиной 0,8 мм. В качестве рабочего геля до уровня на 2,5 см ниже верхнего края пластины полимеризовали экспоненциальный градиент (5—22,5%) ПААГ в 0,375 М Трис-НС1 (pH 8,8) с добавлением 0,1% ДДС-Na, стабилизированный глицерином. Формирующий гель представлял собой 4,75%-ный ПААГ, полимеризованный в 0,125 М Трис-НС1 (pH 6,8) с 0,1% ДДС-Na. Клиновидную полость над пластиной для помещения в нее цилиндри-, ка геля первого направления формировали так, как это принято делать при двумерном электрофорезе [Остерман, 1981]. Эту полость заполняли расплавленным 1%-ным раствором агарозы в том же буфере, а затем закладывали в нее цилиндрик геля. В качестве верхнего электродного буфера использовали, как обычно при электрофорезе по Лэммли, раствор, содержащий 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1 % ДДС-Na (pH 8,3) с добавлением бромфенолового синего в качестве лидирующего красителя. Электрофорез длился 5 ч при силе тока 20 мА. За это время полоса красителя достигала нижнего края пластины. Для окрашивания белков после электрофореза использовали 0,1%-ный раствор СВВ R-250 в 50%-ной ТХУ. Перед авторадиографией гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой от суток до месяца в зависимости от исходной радиоактивности препарата и необходимости выявления слабых пятен. Прн этом следует иметь в виду, что при увеличении продолжительности экспозиции увеличивается и размер каждого пятна — примерно вдвое при 10-кратном удлинении экспозиции. Соответственно может ухудшаться разрешение близко лежащих пятен. [c.47] Во время вымачивания цилиндрика после ИЭФ до 25% белка может вымываться из геля, поэтому О Фаррелл описал вариант методики без промежуточного вымачивания. При этом цилиндрик геля не заплавлялй в агарозу, а в верхний электродный буфер вносили первоначально 2% ДДС-Na, впоследствии заменяя его нормальным буфером, содержащим 0,1% ДДС-Na. [c.47] Исходное количество препарата О Фаррелл варьировал в пределах от 1 до 100 мкг белка. В последнем случае преобладающие белки смеси давали явно перегруженные пятна, но зато могли быть обнаружены белки, содержание которых в исходном препарате было очень низким. Оптимальное количество белка в одном пятне — примерно 0,1 мкг. При перегрузках (более 20 мкг исходной смеси) наблюдались существенные искажения формы некоторых пятен. Обнаруживалось и явление вытеснения белков друг другом — малое пятно при близком соседстве большого оттеснялось из своего нормального положения. [c.47] Вымачивание цилиндриков геля после ИЭФ по методу О Фаррелла приводит не только к потере части белков, но и к некоторому размыванию белковых зон. Кроме того, если желательно при электрофорезе во втором направлении на одной пластине сопоставить белки, сфркуснрованные в разных опытах, то зоны этих белков приходится вырезать вслепую. [c.48] Вернуться к основной статье