ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ Сущность метода из "Исследование биологических макромолекул методами" Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) — один из наиболее эффективных и широко распространенных в настоящее время методов фракционирования и очистки белков. Его используют как на завершающих стадиях эксперимента (аналитический вариант), так и при обработке исходного клеточного гомогената (препаративный вариант). Многие методические приемы, например приготовление гелей полиакриламида н агарозы, окраска белковых полос, элюция белков из гелей и др., роднят ИЭФ с электрофорезом белков, подробно рассмотренным в предыдущей книге [Остерман, 1981]. Фракционирование белков при ИЭФ производится в электрическом поле с помощью тех же приборов, которые используются для электрофореза. Ниже при изложении материала предполагается, что читатель уже знаком с этими методами и аппаратурой. [c.3] Вместе с тем между электрофорезом и ИЭФ существуют важные различия, поскольку фракционирование белков при ИЭФ идет по совсем иному принципу. В процессе электрофоре-. за белки разделяются вследствие различия скоростей их миграции в электрическом поле, которые обусловлены суммарными электрическими зарядами белков в среде с неизменным pH и их размерами, определяющими степень торможения белков о сетку геля. При ИЭФ параметром фракционирования служит значение изоэлектрической точки (р1) белка как цвиттериона. [c.3] Вначале рассмотрим общие характерные особенности метода, чтобы затем обратиться к его техническим деталям и вариантам. [c.4] Смесь белков вносят в трубку или в объем пластины, заполненные электропроводящей жидкостью. Возможность конвекции устраняют либо полимеризацией в этой жидкости сетки ПААГ или агарозы, либо помещением в нее гранулированного сефадекса, либо, наконец, образованием в жидкости градиента плотности раствора сахарозы. Вдоль трубки или одного из линейных размеров пластины в электропроводящей жидкости создают и поддерживают линейный градиент pH в определенном, наперед выбранном интервале значений. Жидкость обладает буферными свойствами, так что установившиеся значения pH вдоль градиента не изменяются в присутствии фракционируемых белков. [c.4] Ниже подробно описано, каким образом выполняются все эти условия и что это за жидкость, но сначала проанализируем поведение растворенных в ней белков после того, как к концам трубки или противоположным торцам пластины присоединили источник напряжения. [c.4] Протекание тока через жидкость сопровождается установлением электрического поля, воздействующего на оказавшиеся в нем белковые молекулы. Это воздействие приводит к их миграции вдоль поля по направлению к аноду или катоду в зависимости от знака суммарного электрического заряда каждой молекулы, подобно тому как это происходит при электрофорезе. Скорость миграции пропорциональна напряженности электрического поля и электрофоретической подвижности белка. Последняя, как известно, зависит от отношения суммарного заряда к линейному размеру белковой молекулы. [c.4] Проанализируем для начала поведение белковых молекул, которые в некоторый момент времени находятся в таком участке градиента, где рН р1, т. е. в кислой для этих белков среде. Очевидно, что они заряжены положительно и под влиянием поля должны мигрировать к катоду. До сих пор ничего не было сказано о направлении изменения pH вдоль градиента. Его создают таким образом, чтобы pH увеличивался в направлении от анода к катоду. По мере движения положительно заряженные белковые молекулы будут переходить в области градиента со все более высокими значениями pH. В силу этого их положительный заряд будет уменьшаться, а миграция — замедляться. Однако до тех пор, пока pH окружающей их среды меньше р1, движение будет продолжаться. Молекулы белка остановятся, лишь достигнув участка градиента, где для них рН=р1. Здесь они утрачивают заряд, так что электрическое поле на них больше не действует. [c.5] Аналогичный процесс, но происходящий в обратном направлении, будет иметь место для тех же белковых молекул, оказавшихся изначально в области рН р1. Заряженные отрицательно, они мигрируют в направлении анода и остановятся тогда, когда достигнут того же самого участка градиента (рН=р1). [c.5] Таким образом, ИЭФ приводит к стационарному состоянию, не ограниченному временем, — это третья особенность процесса. Устанавливается некое динамическое равновесие. Полоса сфокусированного белка не является, разумеется, бесконечно узкой ее ширина пропорциональна количеству содержащегося в ней белка. Но все же она оказывается гораздо более узкой, чем при электрофорезе с такой же степенью загрузки зоны. Чем е полосы, тем ближе друг к другу могут быть значения р1 двух разделяющихся белков. Современная техника электрофокусирования позволяет разделять в виде отдельных полос белки, у которых значения р1 отличаются всего лишь на 0,01. Высокая разрешающая способность — это четвертая особенность метода ИЭФ ее иллюстрирует рис. 1 [Bishop, 1979а]. [c.6] Важной особенностью и достоинством метода ИЭФ является и то, что он позволяет легко определять такой важный параметр белка, как р1. Дело сводится к измерению pH в той точке градиента, где находится зона этого белка после окончания процесса ИЭФ. [c.7] Вернуться к основной статье