ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Сопрягающие органеллы из "Биоэнергетика Введение в хемиосмотическую теорию" Схематическое изображение тонкого среза через митохондрию приведено на рис. 1.4. Митохондрии обычно имеют длину 0,7—1 мкм. Их форма непостоянна и в клетке может меняться. Форма крист в митохондриях, выделенных из различных тканей, также сильно различается, причем это относится даже к одним и тем же митохондриям, суспендированным в различных средах. [c.13] Митохондрии обычно выделяют путем мягкого разрушения ткани в изотоническом растворе сахарозы с последующим дифференциальным центрифугированием, которое позволяет отделить митохондрии от ядер, обломков клеток и микросом (фрагментов эндоплазматического ретикулума). Этот метод пригоден лишь для нежных тканей, таких, как печень. В случае более плотных тканей, таких, как сердечная мышца, их вначале обрабатывают протеазами (типа нагаре, например) или разрушают в гомогенизаторе. Митохондрии из дрожжей выделяют после переваривания клеточной стенки с помощью пищеварительных ферментов улитки. [c.14] При разрушении митохондрий ультразвуком образуются вывернутые субмитохондриальные частицы (СМЧ) (рис. 1.4), которые называют также электронтранспортными частицами (ЭТЧ). Эти частицы имеют центры связывания субстратов дыхательной цепи и АТР-синтетазы на внешней поверхности й потому широко используются в экспериментах (Lee, 1979). [c.14] Хлоропласты получают с помощью мягкой гомогенизации листьев в изотоническом растворе сахарозы или сорбитола при pH 8,0. Благодаря такому pH компенсируется закисление среды при разрушении вакуолей. После фильтрования через муслин гомогенат центрифугируют при небольших скоростях для отделения обломков клеток. Хлоропласты обычно осаждают центрифугированием при 1000—2000 g в течение 4 мин. Эта процедура позволяет получать хлоропласты с интактными внутренней и наружной мембранами (интактные хлоропласты). Такие хлоропласты способны с высокой скоростью фиксировать СОг, так как в них сохраняется содержимое стромы, однако они редко используются в биоэнергетических исследованиях, поскольку многие субстраты и ингибиторы не проникают через мембрану хлоропласта и не могут достичь мембраны тилакоидов. Исследования функций тилакоидов можно проводить на хлоропластах, полученных в 0,35 М Na l, Б них разрушены наружная и внутренняя мембраны, и они неспособны фиксировать СОг, но здесь тилакои-ды доступны для субстратов и ингибиторов (разрушенные хлоропласты). [c.16] Важнейшее положение хемиосмотической теории состоит в том, что система окислительного фосфорилирования может быть функционально и структурно разделена на окислительные и фосфорилирующие протонперено-сящие комплексы. Такое же разделение возможно и в случае фотосинтетического фосфорилирования. После разделения очищенные протонные помпы можно встроить в искусственные замкнутые мембранные пузырьки и наблюдать их протонперенося-щую активность. Подобная реконструкция позволяет, во-первых, проверить различные аспекты хемиосмотической теории. (Все ли комплексы, участвующие в трансформации энергии, переносят протоны Способен ли каждый из таких комплексов переносить протоны самостоятельно или только в сочетании с какой-то гипотетической протонной помпой ) Во-вторых, реконструкция позволяет определить состав минимальной функционирующей единицы, что является первым шагом на пути изучения механизма работы протонной помпы. [c.18] В связи с различной ориентацией реконструированных комплексов в мембране возникает ряд проблем. Иногда значительная кривизна поверхности мембраны приводит к тому, что все белки в ней ориентированы одинаково, однако чаще всего ориентация носит случайный характер. Чтобы предотвратить работу помп в противоположных направлениях, используют не проникающие через мембрану субстраты. В этом случае активными оказываются лищь те ферменты, которые ориентированы своими субстратсвязывающими центрами наружу. [c.19] Вернуться к основной статье