ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ из "Вирусология Методы" Для характеристики вирусов в первую очередь важны их биохимические и биофизические свойства. Чтобы исследовать эти свойства, вирусы необходимо очистить. Разные вирусы требуют специфических методов очистки, и привести их все в данной главе не представляется возможным. Описание методов очистки вирусов животных читатель найдет в других главах книги. Здесь же я рассматриваю принципы, на которых основана разработка методов очистки вирусов растений, и привожу отдельные примеры. После очистки методология исследования биофизических и биохимических свойств одинакова для большинства, если не для всех, вирусов животных, растений и бактерий. В этой главе рассмотрены методы изучения только простейших вирусов, состоящих из белковой оболочки и геномной нуклеиновой кислоты. [c.12] Методики очистки многих вирусов приведены в Описаниях вирусов растений , выпускаемых СМ1/ААВ [1], и в книге [2]. Хотя универсального метода и не существует, изложение основных принципов и фактов может оказаться полезным при разработке способов очистки вирусов. [c.12] В большинстве случаев, однако, невозможно выполнить многие из этих требований. Часто не удается найти подходяш,ее растение, на котором образуются локальные поражения. В этих случаях для контроля количества вируса можно использовать метод дот-блот гибридизации (см. разд. 3.8). [c.13] Чтобы экстрагировать вирусные частицы из растения, необходимо разрушить клеточные стенки и высвободить содержимое клеток. Обычно экстракцию проводят в буферном растворе (для поддержания постоянного значения pH) и в присутствии соединений, предотвращаюш,их повреждение вирусных частиц высвобождающимися ферментами. Кроме того, действие ферментов замедляется, если экстракцию проводят на холоду. Если отсутствуют специальные указания, все стадии очистки следует проводить при О—5°С. [c.13] Наиболее распространенное приспособление для разрушения растительных клеток —это гомогенизатор с вращающимися ножами, которые приводятся в движение сверху или снизу. В продаже имеются различные типы гомогенизаторов, и выбор конкретной модели должен определяться эффективностью разрушения растительных тканей, которая зависит от скорости вращения ножей, размера лезвий, угла между ними и формы сосуда. Эффективность разрушения растительных клеток можно повысить путем их предварительного замораживания, хотя в некоторых случаях это приводит к снижению выхода вируса. [c.13] Органические растворители ), хлороформ, смесь хлороформ/бутаиол (1 1), ацетон эфир или фреои тот или иной растворитель смешивают в равных объемах с экстрактом, центрифугируют и отбирают водную фазу. [c.15] Нагревание. Экстракты прогревают 10 мин при 50—60 С и удаляют денатурированные белки низкоскоростным центрифугированием. [c.15] Бентонит. Используют магниевую соль бентонита, как описано в работе [6]. [c.15] ИЛИ разделения фаз при экстракции органическими растворителями обычно применяют низкоскоростное центрифугирование при 10 000 g в течение 10 мин. [c.15] Концентрирование обычно осуществляют с помощью поли-этиленгликоля (ПЭГ) или путем высокоскоростного центрифугирования. Типичные условия осаждения ПЭГ следующие для палочковидных вирусов используют 2,5% (вес на объем) ПЭГ и 0,1 М Na l, а для изометрических вирусов— 10% (вес на объем) ПЭГ в присутствии 0,1 М Na l для эффективного осаждения необходимо поддерживать достаточно высокую концентрацию соли. Обычно ПЭГ и соль добавляют к раствору, содержащему вирус, растворяют их в течение часа при постоянном перемешивании и затем собирают осадок вируса центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин. Высокоскоростное центрифугирование большинства типичных изометрических вирусов (80—130 S) проводят при 70000 g в течение 3 ч, а большинства палочковидных вирусов (130—180 S)—при 50000 g в течение 2 ч. [c.15] Осветленный и концентрированный вирус еще недостаточно чист для большинства биохимических и биофизических исследований. Дополнительной очистки достигают зональным (скоростным) или равновесным (изопикническим) центрифугированием. Теоретические и практические аспекты центрифугирования детально изложены в другом руководстве [7]. Для вирусов растений можно использовать следующие методы дополнительной очистки. [c.16] Для получения близких к линейным градиентов методом диффузии при -веденные объемы растворов сахарозы наслаивают один на другой и оставляют на ночь при 4 °С для диффузии. [c.17] Зоны вируса обнаруживают при освещении пробирки сверху и извлекают шприцем, проколов пробирку сбоку. Соли цезия затем удаляют диализом. [c.18] Необходимая степень очистки вируса определяется тем, какие биофизические или биохимические методы будут применены для его исследования в дальнейшем. Очевидно, что препараты, используемые для анализа вирусных нуклеиновых кислот или капсидных белков, должны быть очищены от клеточных примесей более тщательно, чем препараты, предназначенные для электронной микроскопии или седиментационного анализа. [c.19] Очищенные препараты некоторых вирусов хранят в замороженном виде при —20°С, однако следует отметить, что замораживание влияет на структуру и стабильность некоторых вирусов. Полезной защитной добавкой может оказаться хлорбутанол (1,1,1-трихлор-2-метилпропанол), не влияющий ни на биологические свойства (в случае вирусов, не имеющих оболочки), ни на спектр поглощения в ультрафиолетовой области. Для предотвращения бактериального роста добавляют один-два кристалла азида натрия при работе с этим веществом следует соблюдать, осторожность. [c.19] Ниже приведены четыре методики очистки вирусов, в которых используют рассмотренные выше приемы. Прежде чем начать работу с любым из вирусов, следует ознакомиться с действующими правилами защиты растений. [c.20] Вернуться к основной статье