ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ из "Иммунологические методы исследований" В этой главе мы подробно опишем методы, используемые нами в настоящее время для конструирования и скрининга космидных библиотек, а также для опытов типа прогулка вдоль хромосомы . Прогулка вдоль хромосомы определяется как метод, используемый для выделения фрагментов ДНК, соседних с данным районом клонированной ДНК. В большинстве случаев такая прогулка осуществляется с помощью скрининга геномных библиотек, полученных из частично гидролизованной ДНК, с использованием меченого уникального рестрикционного фрагмента, выделенного из концевой области клонированного района. Таким образом получают клоны, содержащие перекрывающиеся фрагменты ДНК, и после рестрикционного картирования и соответствующей ориентации фрагментов материал этих клонов может использоваться для продолжения такой прогулки . [c.17] После центрифугирования из пробирок с помощью насоса медленно отбирают фракции по 0,7 мл (собирают около 30 фракций с помощью коллектора). По 10 мкл каждой из фракций ( 1—17) анализируют в 0,3%-ном агарозном геле вместе с маркерными фрагментами ДНК фага К, которые наносят на среднюю и крайние дорожки геля. К маркерным фрагментам добавляют по 10 мкл 40%-ного раствора сахарозы, чтобы концентрация сахарозы и солей в них была такой же, как и в пробах. Длительность электрофореза составляет 16 ч при 40 В. [c.21] Допустим, например, что в чашке Л выросла 1 колония, в чашке — 2 колонии, в чашке В—64 колонии и в чашке Г — 602 колонии, а для упаковки было использовано 0,15 мкг эукариотической ДНК, фракционированной по размерам. Это дает эффективность упаковки, равную 602-1,15-53 . . [c.24] В герметично закрывающиеся полиэтиленовые мешочки и замораживают при —70 °С. Этот набор используют для отсева положительных колоний, выявляемых с помощью радиоактивных зондов. [c.27] Для гибридизации используют зонды, полученные с помощью ник-трансляции (Maniatis et al., 1982) (удельная активность 10 —10 имп/(мин-мкг), и ДНК-конкурент (см. ниже). ДНК денатурируют путем инкубации в кипящей водяной бане или в нагревательном блоке (95 °С) в течение 5 мин и последующего быстрого охлаждения в смеси воды и льда в течение 1—2 мин. 1 мл гибридизационного раствора содержит от 10 до 10 имп/мин. Одновременно можно пользоваться несколькими зондами, однако общая радиоактивность в растворе для гибридизации не должна превышать 10 ими/(мин-мл), чтобы не возникало проблем, связанных с высоким фоном. [c.28] ЦИИ всю стопку фильтров, за исключением верхнего фильтра, переворачивают. [c.29] Один и тот же набор фильтров можно использовать для гибридизации многократно при скрининге библиотеки различными зондами. Удалять меченые зонды от предшествующих циклов гибридизации нет необходимости. Фильтры просто проводят через еще одну реакцию гибридизации, промывают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Новые положительные колонии выявляют путем сопоставления новых пленок с теми, которые были получены в предшествующих гибридизациях. [c.29] После гибридизации гибридизационный раствор сливают и хранят при —20 °С. Его используют для повторного скрининга положительных колоний. Фильтр промывают в коробке двухлитровыми порциями подогретого буфера. Условия промывки можно варьировать. В большинстве случаев мы проводим промывку при 65°С два раза в растворе ЗХ55С, 0,1%-ного ДСН и два раза в растворе 1х55С, 0,1%-ного ДСН. Продолжительность каждой промывки составляет от 20 до 30 мин. Ее осуществляют при постоянном перемешивании на ротационной качалке, снабженной водяной баней. Радиоактивность фильтров после промывки определяют с помощью счетчика Гейгера. По завершении последней промывки она должна быть близка к фону. [c.29] Перед проявлением кассетам дают возможность прогреться до комнатной температуры, удаляют усиливающий экран и пленку и закрывают кассету, чтобы избежать какого бы то ни было движения фильтров на бумаге Whatman 3 ММ. После идентификации положительных колоний (см. ниже) фильтры хранят при —70 °С в картонной коробке, а для дальнейшей работы используют проявленную пленку (разд. IV, Б). [c.30] Вернуться к основной статье