ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Факторы, рассматриваемые перед выбором среды из "Культура животных клеток Методы" При ответе на эти вопросы удобно пользоваться нижеприведенными формулировками, хотя следует иметь в виду, что перечисленные свойства не являются основными для каждой категории, поскольку стираются границы определений, встречаются и исключения из правил. [c.43] Выживание. Поддержание жизнеспособности, морфологии способность к метаболизму (факультативная) и потенциальная способность к дифференцировке. [c.43] Пролиферация или размножение клеток. [c.43] Обычно клетки из первичных эксплантатов здоровых тканей проявляют себя как нетрансформированные в течение первых генераций после выделения. Некоторые клетки остаются такими в течение 50 генераций и более. Такие нормальные клетки требуют обязательного присутствия в определенных количествах высокомолекулярных белков, гормонов и факторов роста даже при культивировании в улучшенных средах. Трансформированные клетки могут расти без ростовых факторов при условии обеспечения незаменимыми неспецифическими добавками. Появляется все больше данных о том, что опухолевые клетки способны стимулировать собственную пролиферацию, продуцируя аутокринные ростовые факторы. [c.43] Более того, оказалось, что некоторые факторы могут проявлять различные функции. Так, например, инсулин оказывается необходимым как для пролиферации, так и для дифферен-дировки. [c.44] Для пролиферации большинства типов нетрансформированных клеток необходимо их предварительное прикрепление к твердому субстрату. Взаимодействие таких клеток со своим окружением определяет многие клеточные свойства. Кроме кроветворных клеток только трансформированные клетки способны размножаться без прикрепления к субстрату. [c.44] 6 будут рассмотрены методы покрытия пластик ов для культуры ткани поли-О-лизином, коллагеном или фибронекти-ном. [c.44] Сложные ростовые потребности большинства клеток млекопитающих создают определенные проблемы в оценке адекватности тест-систем, используемых для определения оптимальных ростовых сред. Более подробно эта проблема рассмотрена в обзоре Хэма [7]. Как правило, длительные (в течение нескольких суток) тесты на размножение клеток предпочтительнее, чем короткие тесты с включением Н-тимидина при оценке клеточной пролиферации, поскольку известен ряд артефактов, стимулирующих пролиферацию клеток [15]. Тем не менее метод оценки включения Н-тимидина часто используется для скрининга, но полученные результаты следует проверять с помощью теста на эффективность клонирования или просто путем подсчета клеток. [c.45] Исследования, проведенные с многими клетками млекопитающих, выявили ткане- и видоспецифичность потребности этих клеток в гормонах и питательных веществах. Хондроциты и фибробласты требуют добавления в основную среду липидов, тогда как эпителиальные клетки в этом не нуждаются. Хондроциты растут в присутствии ФРФ, тогда как кератиноциты и эпителиальные клетки бронхов, молочной железы и предстательной железы требуют добавления ФРЭ. Для кератиноцитов и эпителиальных клеток бронхов требуется также присутствие в среде этаноламина и т. д. [8]. [c.46] Как следует из приведенного обсуждения и из результатов анализа табл. 2.2, большинство бессывороточных сред включает в себя инсулин, трансферрин и селениты. Инсулин добавляется в среду в относительно высокой концентрации (1—10 мкг/мл). [c.46] В целом в настоящее время невозможно установить общие принципы составления универсальной бессывороточной среды. Во многих случаях метод проб и ошибок является единственным методом подбора ингредиентов для оптимальной среды. Как уже говорилось, оптимальной исходной средой для монослойной культуры является смесь DME и F12 в соотношении 1 1с добавлением инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селенита (30 нМ), ФРЭ (25 нг/мл), альбумина (1 мг/мл). Систематическое удаление одного из компонентов может помочь идентифицировать незаменимый фактор или факторы. Предложенный Хэмом [7] метод составления среды по лимитирующему фактору может в ряде случаев привести к выбору оптимальной концентрации незаменимого компонента. Однако этот лобовой подход требует много времени и перебора большого количества вариантов. [c.47] На начальных стадиях отбора удобно воспользоваться списком 44 бессывороточных культуральных сред с различными добавками, приведенным в табл. 2.2. Для начала следует выбрать среду, близкую по составу к той, на которой хорошо росли аналогичные клетки. Следует помнить, что среда, составленная для данного типа клеток, может, как правило, обеспечивать рост другой линии клеток или первичной культуры клеток другого происхождения при условии, что все эти клетки относятся к одному и тому же типу. [c.47] Вернуться к основной статье