ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Особенности субстратной зависимости АТФазных реакций из "Биохимия мембран Кинетика мембранных транспортных ферментов" 5 исследование субстратной зависимости транспортных АТФаз проведено на примере Ыа, К-АТФазы. Этому есть две причины во-первых, авторы располагают большим экспериментальным материалом именно по Ыа, К-АТФазе во-вторых, N3, К-АТФаза представляет собой самую сложную систему среди транспортных АТФаз, так что кинетические методы, пригодные для ее исследования, вполне могут быть использованы и для других АТФаз. Авторы полагают, что многие особенности функционирования и регуляции На, К-АТФазы, выявленные с помощью кинетических методов анализа, будут обнаружены также и при исследовании других транспортных ферментов. [c.67] При кинетическом исследовании АТФаз необходимо учитывать их специфическую особенность АТФ образует комплекс с ионами магния. Возникает два вопроса что является истинным субстратом для АТФаз (МдАТФ, АТФ или оба лиганда вместе) и какую роль играют несубстратные компоненты системы в регуляции АТФазной активности Для На, К-АТФазы эти вопросы приобретают принципиальное значение. [c.67] На эти вопросы были предприняты попытки ответить двумя способами прямым измерением связывания лигандов и кинетическим анализом зависимости скорости гидролиза и фосфорилирования от концентрации лигандов. Результаты этих исследований можно суммировать в виде следующих основных выводов. [c.67] Кинетические кривые обычно исследуют при фиксированных концентрациях свобод-Рис. 15. Зависимость Na, К-АТФазной активности ного АТФ, Mg + и (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации 5 кпмппркгя Мо-ДТФ (мМ) в обратных координатах при различных кон- V. [c.68] Прямые проведены методом наименьших квадратов, и параметры прямых статистически обработаны. [c.71] В этих условиях зависимость наклона кривой от А проявляла четко выраженную линейность (рис. 17, А), а зависимость точки пересечения от А имела более сложный характер (рис. [c.71] При фиксировании концентрации М АТФ кривые имеют сложную форму (рис. 19). Например, при 5 = 0,1 мМ зависимость 1/и = =/(Л1) имеет четко выраженный экстремум и точку перегиба. Следует отметить, что при 5=соп 1 и стремлении одного из свободных лигандов к нулю, концентрация второго свободного лиганда возрастает. Этот процесс сопровождается уменьшением ферментативной активности. Следовательно, в отсутствие одного из свободных лигандов второй играет роль ингибитора и не может быть истинным субстратом для N3, К-АТФазы. [c.72] Отклонение от линейности при М=соп51 указывает, что модель, изображенная на схеме 1, не является минимальной и ее следует расширить. Это означает появление дополнительных участков связывания и новых ступеней в кинетической схеме. [c.72] На основе представленного выше экспериментального материала и литературных данных аналогичного характера можно сформулировать необходимые условия, выполнение которых будет носить обязательный характер для истинной минимальной модели Ма, К-АТФазной системы. [c.72] Условие 4. Значение коэффициентов асимптоты функции Ua = —f t) зависит от величины фиксированного А. Должны выполняться следующие условия наклон асимптоты является линейной функцией А отсекаемый асимптотой отрезок ординаты имеет вид гиперболической функции при малых значениях А первая производная отрицательна, при больших — равна нулю. [c.73] Условие 5. Из экспериментов с фиксированием концентрации MgATO вытекают следующие условия кривые имеют точку экстремума в зависимости от значения 5 кривая может иметь точку перегиба кривая имеет асимптоту. [c.73] Это условие вытекает из экстраполяции кривых при экстремально большой концентрации лигандов. Его выполнение не вызывает сомнения при малых значениях свободного АТФ. Однако при очень больших значениях свободного АТФ из-за резкого увеличения спонтанного расщепления АТФ и одновременного уменьшения активности резко увеличивается относительная ошибка измерения, что снижает достоверность определения предела lim v при А- оо. Поэтому в дальнейшем не будет исключаться возможность, что limu=0, при S- oo и А- оо. [c.73] Вернуться к основной статье