ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Методы выделения мономеров из "Практическая химия белка" Выделение и очистку мономеров с целью определения аминокислотного состава, получения пептидных карт или секвениро-ваиия осуществляют с помощью препаративных методов химии белка. [c.37] При работе с микроколичествами материала в белок вводят радиоактивную метку и пользуются аналитическими методами. Метка может быть внутренней (т. е. введенной in vivo) [14, 161] или присоединена химическими методами по функциональным группам аминокислот (как указано в разд. 1.4.5.1). [c.37] Для разделения используют легколетучие буферные системы, в частности разбавленные растворы аммиака, уксусную и муравьиную кислоты, что позволяет выделять белки из элюатов с помощью лиофильного высушивания. Препараты для аминокислотного анализа рекомендуется получать гель-фильтрацией в 50—75%-ной муравьиной кислоте. Муравьиная кислота, сильный денатурирующий и солюбилизирующий агент, вызывает разрушение носителей на основе полисахаридной матрицы в частности, не рекомендуется оставлять сефадексы в контакте с 75%-ной муравьиной кислотой на срок более трех недель. [c.37] Колонки изготовляют из стекла, соединительные шланги — из тефлона (рис. 1.3). Белки выделяют из элюата с помощью лиофильного высушивания в вакуумной системе с ловушками, предварительно фракции разбавляют до концентрации муравьиной кислоты --10%. Принято считать, что муравьиная кислота не гидролизует пептидные связи, за исключением лабильной связи Asp-Pro. [c.37] Стеклянная хроматографическая колонка, предназначенная для проведения хроматографии с использованием в качестве элюента муравьиной кислоты. [c.38] представляющие интерес, вырезают и белок выделяют экстракцией [49, 64] или элюированием в условиях электрофореза [2, 175]. При определении аминокислотного состава приготовленных таким способом образцов обязательно вводят необходимые поправки, учитывающие присутствие акриламид-ного геля [26]. Согласно другому варианту, белки разделяют электрофорезом в блоке акриламидного геля, при этом под действием электрического поля белковые фракции попадают в проточную камеру, откуда и вымываются раздельно потоком элюэнта. Ход элюирования регистрируют с помощью проточного денситометра, элюат собирают на фракционном коллекторе. Недавно разработана методика элюирования белков из системы ПААГ —ДСН в промежуточный гель с использованием восходящего электрофореза [121]. Выход достигается высокий, однако образец может содержать примеси компонентов акриламидного геля и буферной системы. Гели для препаративного электрофореза могут иметь форму столбиков (LKB) или пластин (блоков) (Biorad). Для разделений по описанной методике 1 сп()льзуют различную аппаратуру, выпускаемую фирмами. [c.39] Выбор ионообменника зависит от свойств исследуемых белков. Обычно хроматографию проводят в том буфере, при котором целевые компоненты смеси предельно различаются по величине суммарного заряда. При выборе рабочего диапазона pH можно руководствоваться результатами электрофореза или изоэлектрофокусирования (т. е. изоточками компонентов смеси) (разд. 1.3.2.4). При отрицательном суммарном заряде хроматографию проводят на анионите, при положительном суммарном заряде — на катионите. Выбору оптимальных условий ионообменного разделения должна предшествовать предварительная оценка свойств разделяемой смеси с помощью простых тестов. [c.40] Методика проведения ионообменной хроматографии. Исчерпывающую информацию относительно свойств и физических характеристик различных ионитов, а также практические рекомендации по работе с ними можно найти в материалах, выпускаемых фирмами-изготовителями. Хороший обзор по целлюлозным ионообменникам опубликован Петерсоном [133]. [c.41] Сухой ионит предварительно подвергают кислотной и щелочной обработке и лишь затем уравновешивают рабочим буфером. Аниониты, например ДЭАЭ-целлюлозу, суспендируют в 0,5 М НС1 (15 мл/г) и перемешивают в течение 30 мин. Жидкость отделяют фильтрованием, ионит промывают водой и суспендируют при перемешивании в равном объеме 0,5 М NaOH в течение 30 мин. Жидкость вновь отделяют, ионит промывают водой. Затем ионит суспендируют в рабочем буфере (20 мл/г), перемешивают в течение 10 мин, отделяют путем декантации и фильтрованием. Операцию повторяют трижды до тех пор, пока pH и электропроводность жидкости над ионитом не сравняется с параметрами рабочего буфера. Катиониты обрабатывают аналогичным образом, однако в иной последовательности. Например, КМ-целлюлозу промывают вначале 0,5 М ЫаОН, а затем 0,5 М НС1. Иониты, поставляемые во влажном виде, не нуждаются в предварительной тренировке , их уравновешивают рабочим буфером по обычной методике. [c.41] Далее удаляют мелкую фракцию ионита. Суспензию взмучивают в мерном цилиндре, оставляют в покое для отстаивания в течение 1 ч, жидкость отбрасывают. [c.41] Готовят суспензию, свободно пропускающую пузырьки воздуха, деаэрируют в вакууме водоструйного насоса и набивают колонку. Для препаративных целей используют колонки диаметром 1,5ч-2,5 см, длиной 50- 100 см перед набивкой колонку снабжают насадкой, позволяющей в один прием внести всю массу ионита. После набивки пропускают через слой ионита I—2 объема рабочего буфера. Скорость промывания должна быть идентична предполагаемой скорости элюирования, а объем сорбента должен оставаться постоянным. [c.42] Образец растворяют в исходном буфере, в случае необходимости диализуют в течение 12 ч. Если целевые компоненты смеси сорбируются достаточно прочно, объем раствора образца значения не имеет. В случае слабой сорбции объем вводимого в колонку образца не должен превышать 1—2% ее объема. Нагрузка должна быть 10% емкости сорбента. [c.42] Ход элюирования регистрируют по изменению оптической плотности при 280 нм (или с помощью методов, описанных в разд. 1.2.2.1), элюат собирают по фракциям. Компоненты смеси, удерживаемые ионитом, элюируют, изменяя ступенчато или плавно ионную силу или pH рабочего буфера. Элюирование в ступенчатом градиенте приводит к появлению артефактов и вследствие этого применяется все реже. [c.42] Способы формирования градиентов. Градиент концентрации или градиент pH формируют с помощью двух сообщающихся сосудов или перистальтического насоса. Выпускаются также специальные формирователи градиента. [c.42] Способы формирования градиента с помощью сообщающихся сосудов (а) и перистальтического насоса (б). / — смеситель 2 — резервуар. Форма градиента определяется площадью поперечного сечения сосудов (а) или диаметром эластичных трубок перистальтического насоса (б). [c.43] У большинства перистальтических насосов скорости потока и Rг можно варьировать путем изменения диаметра трубок. Выпускаются насосы, позволяющие варьировать скорости потоков в широком диапазоне. Если диаметр трубок можно варьировать в ограниченных пределах, линейный градиент формируют с помощью трех каналов одинакового диаметра. По одному каналу подают буфер из сосуда 2 в сосуд /, а по двум остальным — буфер из сосуда 1 в колонку. [c.43] Выбору оптимальных условий электрофореза в ПААГ посвящена работа [33]. Имеется компьютерная распечатка 5000 буферных систем для электрофоретического разделения катионов и анионов в диапазоне pH 2,5—11 [35]. На практике используются лишь немногие из этих систем с наиболее типичными pH [119]. Далее описана система, предложенная Девисом [43], несколько модифицированная путем введения 8 М мочевины. [c.44] Часто возникает задача определения молекулярных масс белков, которые удалось электрофоретически разделить по величине заряда. В этом случае проводят электрофорез в трубке в присутствии 8 М мочевины, а затем в перпендикулярном направлении в блоке в присутствии ДСН (двумерный электрофорез в геле обсуждается в разд. 7.3,2). [c.44] Вернуться к основной статье