ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Трудности, связанные с разделением белков методом ИЭФ из "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" Другая проблема, возникающая при ИЭФ, связана с образованием на аноде кислорода,. который частично растворяется в среде н может окислять ЗН-группы белков. Чтобы предотвратить такое окисление, необходимо максимально сократить, насколько это допустимо, время проведения ИЭФ или добавить в среду восстанавливающие агенты, такие, как аскорбиновая кислота или тиоловые соединения [616]. [c.163] Особое внимание при проведении ИЭФ нужно уделять белкам, неустойчивым в кислой или щелочной среде, В этих случаях рекомендуется вносить пробу в зону безопасных значений pH, избегать ее непоаредственного контакта с элекгрол-ными растворами, а после получения фракций, содержащих рН-чувствительные белки, как можно быстрее нейтрализовать их [1347]. [c.163] Некоторые факты указывают на то, что выявляющаяся при ИЭФ неоднородность белкового препарата иногда обусловлена не его исходной молекулярной гетерогенностью, а использованным методом разделения. К появлению множественных полос приводит скорее всего взаимодействие белков с амфолита-ми-носителям и. Фрейтер [398] показал, Что некоторые белки шерсти дают целый ряд артефактов при ИЭФ в полиакриламидном геле. Аналогичные явления наблюдались при исследовании дрожжевой изоцитратдегидрогеназы [609], церулоплаз-мина [986], альбумина [659] и оксидазы Ь-аминокислот [1405]. [c.163] Для решения вопроса о том, отражают ли обнаруженные при ИЭФ множественные полосы или зоны истинную гетерогенность белкового препарата или обусловлены взаимодействием белка с амфолитами-носителями, выделенные фракции следует подвергнуть повторному фокусированию при различных количественных соотношениях между амфолитами и белками. [c.163] Схематическое изображе ние концентраций двух ионов, имеющих разные подвижности при изотахофорезе. [c.166] Уравнение (13) вывел Роутс [1116]. Оно представляет собой расширенную форму регулируюш,ей функции Кольрауша. Согласно этому уравнению, концентрация вещества В в зоне 2 определяется концентрацией вещества А в зоне 1. [c.168] Помимо баланса электрического тока, подробно описанного выше, существуют еще три других важных принципа, которые необходимо иметь в виду. [c.168] Баланс масс. Концентрация противоионов в зоне должна оставаться постоянной после достижения состояния равновесия, т. е. необходимо, чтобы количества противоионов, входящих в зону и покидающих ее, были равны между собой. [c.168] Электронейтральность. Число положительно и отрицательно заряженных ионов в данной зоне одинаково. [c.168] Химическое равновесие. Содержание диссоциированных и недиссоциированных молекул определяется константам и кислотно-щелочного равновеоия. [c.168] Основываясь на этих принципах, можно вывести несколько уравнений, позволяющих рассчитать системы для изотахофореза катионов [99], анионов [348] и белков [233, 646, 1116]. Более детальное описание метода читатель найдет в ряде прекрасных обзоров [347, 352, 353, 906, 1116]. [c.168] Как уже отмечалось, концентрации ионов в зонах не могут отличаться от той, которая задана концентрацией ведущего иона и подвижностями ведущего и исследуемого ионов. Если же концентрация какого-либо иона, содержащегося в пробе, не подчиняется этому правилу, вытекающему из регулирующей функции Кольрауша, то он непременно подвергнется разведению или сконцентрируется до предписанного уровня (рис. 64). Вследствие этого изотахофореграмма отличается от всех других видо в фореграмм и хроматограмм. На ней высота ступенек, образуемых сигналами, является характеристикой каждого вида иона, а расстояние между сигналами дает информацию о числе ионов. [c.169] Для разделения с помощью изотахофореза двух ионов необходимо, чтобы их подвижности различались по крайней мере на 10% [99]. Подвижность иона зависит от нескольких параметров, например сольватации, вязкости растворителя, диэлектрической постоянной, наконец, радиуса и заряда иона [99]. Ее можно изменять, варьируя растворители или pH, определяющий соотношение между диссоциированными и недиссоцииро-ван ыми молекулами. Так, ионы К+ и NH+4 имеют в воде почти одинаковую подвижность, между тем они очень хорошо разделяются в метаноле [98]. Подвижность белков сильно зависит от pH, поэтому pH играет решающую роль при изотахофорезе белков. Все зоны имеют разные величины pH. В анионной системе величина pH обычно возрастает в направлении от ведущего иона к замыкающему. При экстремальных значениях pH (ниже pH 3 и выше pH 10) условия изотахофореза нарушаются, так как ионы Н+ и 0Н сами обеспечивают проводимость. Присутствие карбоната при высоких pH также оказывает неблагоприятное действие [501, 1116]. Если в анионной системе величина pH более чем на 1 единицу ниже (а в катионной системе выше), чем величины р/С соответствующих видов ионов, то эффективная подвижность окажется настолько низкой, что возникает потребность в очень высоком градиенте напряжения,. который невозможно обеспечить доступными источниками питания. Степень варьирования pH ограничена также буферной емкостью противоиона [99]. [c.170] Для получения воспроизводимых результатов очень важно выполнять следующие условия [353]. Изотахофорез следует проводить в трубке с совершенно одинаковым по всей ее длине внутренним диаметром, при постоянном составе ведущего электролита необходимо соответствующим образом предотвратить поя вление электроэндосмоса и гидродинамического тока жидкости, а также обеспечить равномерное охлаждение трубки буферная емкость ведущего электролита должна быть достаточно большой, чтобы препятствовать смещению зон pH в обратном направлении по сравнению с движением зон исследуемых веществ. [c.171] Описана конструкция аппарата для изотахофореза, представляющего собой единый термостатируемый блок, включающий отсеки для электродов, входное отверстие для пробы, неэластичные прямоугольные капилляры с поперечным сечением 0,2X1 мм и длиной 25 см и детекторную ячейку [138]. [c.171] Изотахофорез можно также проводить на полосках из ацетата целлюлозы [1349] и сочетать с классическим электрофорезом в опытах по двухмерному разделению [1188, 1351, 1352]. [c.171] Вернуться к основной статье