ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Краткий обзор групп методов исследования биомембран из "Биологические мембраны Структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами" Методы исследования биологических мембран весьма разнообразны и условно объединены в 5 групп биохимические, физиологические, иммунологические, генетические, биофизические. [c.202] Биохимические методы позволяют разделять, выделять и анализировать в чистом виде липидные и белковые компоненты, изучать их физико-химические свойства в свободном состоянии и в составе надмолекулярных комплексов в условиях воздействия различных внешних факторов (температуры, концентрации водородных ионов и др.), исследовать их время жизни , пути биосинтеза и распада этих компонентов. К ним относят методы выделения (недеструктивные и включаюп] ие разрушение клеток) разделения субклеточных фрагментов (хроматография, электрофорез, центрифугирование, иммуноаффинные методы) идентификации и оценки чистоты субклеточных фракций выделения органелл и мембранных систем экстракции липидов и разделения их по классам количественного определения фосфолипидов исследования трансмембранного распределения липидов солюбилизации мембранных белков, их реконструкции и определения функциональной активности реконструированных мембран, выделения и модификации мембранных белков. [c.202] Физиологические методы используют для изучения функционирования естественных и искусственных мембран. Они позволяют исследовать проницаемость мембран, процессы возбуждения, торможения, проведения нервного импульса, распределения и выведения иоЬов и молекул из клеток и тканей, изменения физиологических функций клеток. [c.202] Генетические методы основаны на использовании мутантов, дефектных по синтезу определенных мембранных белков. Они позволяют исследовать функции мембранных белков, их роль в функционировании мембран, проблемы самоорганизации мемб-ран. [c.203] Биофизические методы позволяют изучать динамическую организацию биомембран, получить представления об упаковке и движении липидных молекул в природных и модельных мембранах, их взаимодействии друг с другом и молекулами белков, исследовать фазовые переходы и другие процессы. К ним относятся дифракционные методы (рентгеновская дифракция, дифракция нейтронов), резонансные методы, метод электронной микроскопии, оптические методы (круговой дихроизм, дисперсил оптического вращения, абсорбционная спектроскопия, люминесценция, метод флуоресцентных зондов), метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии, метод моделирования и получения искусственных мембран и др. [c.203] Дифракционные методы основаны на взаимодействии электромагнитного излучения или частиц с длиной волны, соизмеримой с межатомным расстоянием, и компонентов мембраны. Их используют для определения геометрических параметров структуры типа липидной мезофазы и ее периодичности, толщины бислоя, среднего расстояния между углеводородными цепями. К этим методам относятся рентгеновская дифракция (рентгеноструктурный анализ) и дифракция нейтронов. [c.203] В основе рентгеноструктурного анализа лежит взаимодействие рентгеновского излучения с электронами вещества, в результате которого возникает дифракция рентгеновских лучей с длиной волны -0,1 нм. Последние рассеиваются на электронных оболочках атомов. Интерференция волн, рассеянных веществом, приводит к возникновению дифракционной картины, что позволяет зарегистрировать рентгенограмму. При рассеянии ыа кристалле можно рассматривать дифракцию как отражение рентгеновских лучей плоскостями кристаллической решетки- Дифракция наблюдается, если рассеянные волны находятся в фазе, т.е, разность хода лучей равна целому числу волн п. [c.203] На основании дифракционной картины, получаемой для рентгеновских лучей с известной длиной волны, определяют параметр d. Дифракционная картина зависит от длины волны рентгеновских лучей и строения объекта. Анализ дифракционных максимумов позволяет установить распределение электронной плотности в кристалле. Рентгеноструктурный анализ дает информацию о расположении атомов в молекулах и кристаллах. [c.204] Для построения профилей электронной плотности, а также для изучения ориентации и характера упаковки углеводородных цепей используют мультислои липидов или смесей липидов и белков, ориентированные на твердой подложке. Их получают путем постепенного нанесения липидов при многократном прохождении стеклянной пластины сквозь монослой липида на границе раздела вода — воздух или путем спонтанного образования мультислоев, параллельных подложке, при испарении органического растворителя из капли липидного раствора. [c.204] Метод рентгеновской дифракции позволяет установить наличие бислойной структуры в природных и модельных мембранах и определить параметры бислоя. На основании анализа дифракционной картины можно исследовать состояние углеводородных цепей мембранных липидов и зарегистрировать фазовый переход из гелеобразного в жидкокристаллическое состояние. Однако из-за высокой лабильности и сравнительно малой упорядоченности структуры биомембран метод рентгеноструктурного анализа не позволяет изучить локализацию мембранных белков. Лишь в мембранах, содержащих упорядоченные белковые комплексы, удается выявить наличие и ориентацию а-спиральных участков интегральных белков. [c.204] Резонансные методы анализа веществ подразделяют на метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). [c.205] Метод ЯМР основан на резонансном поглощении в сильном внешнем магнитном поле энергии электромагнитного радиочастотного поля системой атомных ядер, обладающих магнитным моментом. Он позволяет получать сведения о подвижности молекул липидов биомембран, об упаковке фосфолипидных молекул в бислое, используется для регистрации изменений значения pH в частицах малого размера (искусственные мембраны, митохондрии), изучать процессы латеральной диффузии липидов и трансбислойного движения ( флип-флоп -переходы) молекул. [c.205] Величина 6 для алифатических протонов варьирует от -0,5 до -2,0, ароматических протонов — от -6,0 до -8,5. В качестве эталона для протонного резонанса органических соединений используют тетраметилсилан (СНд) 81, а для водных растворов биополимеров — 2,2-диметил-2-силанпентан-5-сульфоновую кислоту 1ДСС). При высоком разрешении наблюдается сверхтонкая (мультиплетная) структура линий ЯМР, возникающая вследствие магнитного взаимодействия между ядрами, передаваемого через электроны связи (непрямое снин-спиновое взаимодействие). [c.205] К недостаткам метода ЯМР следует отнести низкую чувствительность (концентрация образца должна быть не менее 10 моль/л), а также малую эффективность в изучении крупных молекул, т.е. мембранных белков. [c.205] Если производное такого радикала присоединяется к белку или липиду ковалентной связью, то такое производное называют спиновой меткой, а если с помохддью электростатических сил и гидрофобных взаимодействий — то спиновым зондом. [c.206] Выбор спинового зонда или метки определяется задачами исследования. Так, для изучения характера движения липидных молекул используют липофильные спин-меченные жирные кислоты, глико- и фосфолипиды. Последние применяют также для исследования латерального фазового разделения липидов и ли-пид-белковых взаимодействий. [c.206] Гидрофильные спиновые зонды, представляющие собой модификацию зонда TEMPO и изменяющие свой заряд в зависимости от величины pH, способны связываться с различными участками полярных групп мембраны за счет электростатических взаимодействий. Их используют для исследования поверхностного потенциала и плотности заряда мембранной поверхности. [c.207] Более предпочтительным для изучения биомембран является одновременное применение нескольких зондов, по-разному взаимодействующих с компонентами мембран, что позволяет исследовать цитоплазматическую и наружную поверхности мембран клеток и клеточных органелл. [c.207] Таким образом, метод ЭПР применяют для изучения фазовых переходов в липидном бислое, микровязкости мембран, подвижности углеводородных цепей, латеральной диффузии и флип-флоп -переходов. Недостаток этого метода заключается в том, что введение зонда изменяет структуру бислоя и свойства мембраны. Метод ЭПР более чувствителен по сравнению с методом ЯМР, так как магнитный момент электрона в 1000 раз выше, чем ядра. [c.207] Оптические методы позволяют получить информацию о механизме фотосинтеза, электронном транспорте, транспорте кислорода в тканях, транспорте ионов, взаимодействии веществ различной природы с мембранами, белок-липидных взаимодействиях и других процессах. Они основаны на присутствии в изучаемой системе эндогенных или экзогенных (вносимых в систему экспериментатором) хромофорных групп. К эндогенным хромофорам относятся порфирины, флавины каротиноиды, пиридиннуклеотиды, цитохромы, гемоглобин, миоглобин, которые поглощают свет в видимой области спектра. Акридины, нафталин-сульфонаты, цианины являются экзогенными хромофорами. К оптическим методам относят абсорбционную спектрофотомет-рию, люминесценцию, метод флуоресцентных зондов, а также круговой дихроизм, дисперсию оптического вращения. Последние наряду с ИК-спектроскопией и спектроскопией комбинационного рассеяния используются для определения содержания различных элементов вторичной структуры молекулы белка, позволяют изучать ее конформационные переходы. [c.208] Вернуться к основной статье