ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Гены и ферменты из "Генетика человека Т.2" Подобные соображения привели нас к следующему выводу. Изучение общей проблемы генетического контроля биохимических реакций, определяющих развитие и метаболизм, должно проводиться с помощью процедуры, противоположной общепринятой вместо того чтобы пытаться выяснить химические основы известных наследственных признаков, необходимо установить, обеспечивают ли гены контроль известных биохимических реакций и как они это делают. Нейроспора, относящаяся к аскомицетам, обладает свойствами, позволяющими реализовать такой подход и одновременно служит удобным объектом для генетических исследований. Вот почему наша программа была построена на использовании именно этого организма. Мы исходили из того, что облучение рентгеном вызывает мутации в генах, контролирующих определенные химические реакции. Пусть для выживания в данной среде организм должен осуществлять какую-то химическую реакцию, тогда мутант, лишенный такой способности, в этих условиях окажется нежизнеспособным. Однако его можно поддерживать и изучать, если выращивать в среде, к которой добавлен жизненно необходимый продукт генетически блокированной реакции . [c.8] Далее Бидл и Татум приводят описание схемы эксперимента (рис. 4.1). В состав полной среды входил агар, неорганические соли, солодовый экстракт, дрожжевой экстракт и глюкоза. Минимальная среда содержала только агар, соли, биотин и источник углерода. Наиболее подробно были исследованы мутанты, которые росли на полной среде и не росли на минимальной. Чтобы установить соединение, синтез которого нарушен у каждого из мутантов, в минимальный агар вносили отдельные компоненты полной среды. [c.9] Гипотеза один ген-один фермент получила прочное экспериментальное подтверждение. Как показали работы последующих десятилетий, она оказалась удивительно плодотворной. Анализ дефектных ферментов и их нормальных вариантов позволил вскоре выявить такой класс генетических нарушений, которые приводили к изменению функции фермента, хотя сам белок по-прежнему обнаруживался и сохранял иммунологические свойства. В других случаях менялся температурный оптимум активности фермента. Некоторые варианты можно было объяснить мутацией, влияющей на общий регуляторный механизм и изменяющей в результате активность целой группы ферментов. Подобные исследования привели к созданию концепции регуляции активности генов у бактерий, которая включала и концепцию оперона. [c.9] Было сделано заключение, что в указанных случаях болезни Гирке с летальным исходом имел место дефект глюкозо-6-фос-фатазы. Однако в большинстве более легких случаев активность этого фермента оказалась не ниже, чем при циррозе печени, и только у двух больных она была несколько меньшей (рис. 4.2). [c.10] Хотя по степени проявления различные формы этого заболевания несколько различаются, в клиническом отношении между ними много общего. За одним исключением, все они наследуются по аутосомно-рецессивному типу. Если бы ферментативные дефекты не были раскрыты, патология накопления гликогена рассматривалась бы как одно заболевание с характерными внутрисемейными корреляциями по тяжести течения, деталям симптоматики и срокам летального исхода. Таким образом, перед нами пример, когда генетическая гетерогенность, которую можно было лишь предполагать на основании изучения фенотипа (разд. 3.3.5), подтвердилась при анализе на биохимическом уровне исследование ферментативной активности позволило идентифицировать специфические гены. [c.11] В последующие годы темп исследований в области ферментативных дефектов нарастал, и для 588 идентифицированных рецессивных аутосомных генов, которые Мак-Кьюсик описывает в шестом издании своей книги Менделевское наследование у человека (1983) [133], более чем в 170 случаях обнаружены специфические ферментативные нарушения. Наши успехи в этой области непосредственно связаны с развитием концепций и методов молекулярной генетики. [c.11] Круг рассматриваемых вопросов. В каждом случае ферментативного дефекта необходим особый подход в методологии исследований и интерпретации результатов. Ограниченный объем настоящего обзора заставляет нас обсуждать эти проблемы кратко и весьма избирательно. Основное внимание будет уделено вопросам 1) важным для понимания общих принципов генетической детерминации и генетического контроля у человека 2) важным для диагностики ферментативных дефектов и для понимания связи нарущения с этиологией заболевания. Читателям, желающим ознакомиться с группами заболеваний, не рассмотренными в этой главе, мы рекомендуем обратиться к специальным монографиям [203 182]. [c.12] Различия в подходах к исследованию человека и нейроспоры. Успехи в изучении ферментативных нарушений у бактерий и нейроспоры были достигнуты благодаря новому направлению исследований. Авторы при этом не пытались выявить биохимическую природу уже известных мутаций, они индуцировали новые мутации и отбирали среди них те, которые затрагивали известные биохимические реакции. Такой подход дает возможность обнаружить лишь те мутации, которые действительно приводят к появлению дефектов ферментативных систем независимо от того, какую долю в общем числе мутаций они составляют. [c.12] Среди умственно отсталых детей, которые содержатся в больницах, около 1% страдают фенилкетонурией. Впервые это патологическое состояние было обнаружено Фёллингом в 1934 г. при исследовании двух сибсов, моча которых отличалась характерным мышиным запахом и повышенным содержанием фенилпирувата [1080]. Это открытие навело на мысль, что и другие случаи умственной отсталости связаны с врожденными нарушениями метаболизма. Однако многочисленные исследования мочи умственно отсталых больных почти не дали результатов. Хотя и были открыты некоторые другие заболевания, например гомоцистинурия (см. ниже), в большинстве случаев умственной отсталости врожденных нарушений метаболизма, которые можно было бы обнаружить подобным способом, не было. [c.13] Клиническая диагностика нарушений метаболизма. Болезни, вызванные наследственными нарушениями метаболизма, встречаются довольно редко. Это значит, что даже активно работающий педиатр за все время своей практики встретится лишь с несколькими случаями, поэтому трудно ожидать от каждого врача постановки правильного исчерпывающего диагноза и, тем более, правильного лечения. В США и Европе существует несколько педиатрических центров, специализирующихся в области диагностики (в том числе пренатальной) и лечения отдельных заболеваний или небольших групп болезней, обусловленных наследственными повреждениями ферментов. Такая узкая специализация позволяет обеспечить высочайший на сегодня уровень медицинского обслуживания. [c.13] Однако долг каждого врача независимо от области его специализации (будь то общая терапия, педиатрия или медицинская генетика) - правильно диагностировать заболевания, вызванные наследственными нарушениями метаболизма. Ранняя диагностика важна не только в отношении болезней, для которых существует специальное лечение (разд. 4.2.2.9), но и в тех случаях, когда необходимо предотвратить рождение больных детей (пренатальная диагностика). [c.13] Методы изучения ферментативных нарушений. При изучении ферментативных нарушений пользуются методами энзимо-логии. Для выяснения генетической природы того или иного дефекта важны не только количественные изменения активности фермента, но и качественные различия в характеристиках нормального и измененного фермента. [c.13] Часто разница между нормальным и дефектным ферментом выявляется на уровне белков, например по изменению электрофоретической подвижности. В таких случаях у измененного белка потеря или снижение каталитических свойств далеко не всегда сопровождаются изменением его иммунологических характеристик, т.е. белок сохраняет способность связываться с антителами против нормального фермента. Впервые такой перекрестно-реа-гирующий материал (ПРМ, англ. RM) описан у бактерий (триптофансинтаза у Е. соН). Подобные перекрестно-реагирующие белки часто обнаруживают при наследственных нарушениях ферментов у человека (табл. 4.2) они играют важную роль в выявлении гетерозигот-носителей гемофилии А (разд. 4.2.2.S). [c.14] Приведенный ниже метод имеет особое значение для анализа повреждений ферментных систем. [c.14] Изучение ферментативных нарушений в культуре фибробластов человека. В 1940-1950 гг., когда удалось получить ответы на ключевые вопросы генетики бактерий, многим ученым казалось, что изучение индивидуальных клеток высших организмов позволит увеличить разрешающую способность генетического анализа эукариот на несколько порядков [162]. Условия культивирования клеточных линий были разработаны несколькими годами раньше. Однако все линии клеток, способные размножаться в культуре неопределенно долгое время, либо получены из злокачественных опухолей, как одна из наиболее распространенных линий-НеЬа, либо при культивировании утрачивают способность к контактному торможению, т.е. трансформируются . Генетически такие клетки отличаются от нормальных они почти всегда анеуплоидны, причем число хромосом в наборе колеблется внутри одной клеточной линии и даже внутри конкретной культуры. Трансформированные клетки непригодны для генетического анализа, необходимо разработать методы, позволяющие культивировать нормальные, эуплоидные клетки. [c.14] Количественные биохимические эксперименты, например измерение активности ферментов, имеют смысл, только если рост клеток можно тщательно контролировать. Полезно рассмотреть принципы этих методов, поскольку они применимы и для анализа клеток из амниотической жидкости. [c.14] Возможные трудности. Метод культивирования фибробластов сопряжен с рядом трудностей. Эти клетки плохо растут или вовсе не растут на химически определенных средах. Приходится добавлять сыворотку, содержащую полный набор необходимых питательных веществ. Как правило, для этого используют эмбриональную сыворотку теленка. К сожалению, очень трудно раз и навсегда стандартизировать условия культивирования необходимо постоянно контролировать и уточнять такие параметры, как pH, содержание глюкозы и др. [c.14] Рост фибробластов в культуре. Материал, полученный при биопсии кожи и предназначенный для хромосомного анализа, измельчают, помещают в чашки Петри с питательной средой. Чашки содержат в инкубаторе с 5%-ным СО2. Это позволяет поддерживать постоянный pH. Приблизительно через 15 дней фибробласты начинают расти на поверхности среды и в конечном итоге формируют монослой. Клетки отделяют от поверхности обработкой трипсином и после центрифугирования переносят в свежую среду. [c.15] Развитие культуры происходит циклично. Цикл состоит из начальной лаг-фазы, за которой следует фаза логарифмического роста, продолжающаяся до тех пор, пока количество клеток в культуре не достигает стационарного значения ( лаг-лог стационарный цикл ), В течение цикла активность ферментов и внутриклеточная концентрация метаболитов меняются. Поэтому сравнивать биохимические характеристики можно только с учетом изменений этих параметров на протяжении всех стадий цикла. [c.15] использование фибробластов человека в энзимологических экспериментах требует огромной и кропотливой технической работы [1208]. Затраченный труд, однако, как правило вознаграждается. Именно в культуре фибробластов у больного галактоземией удалось показать нарушение функций галактозо-1-фос-фат—уридилтрансферазы [1177]. Благодаря этому методу бы.ли обнаружены многие нарушения функций ферментов. Он лежит и в основе пренатальной диагностики, которая в настоящее, время с успехом используется для изучения генетически обусловленных повреждений ферментов. [c.15] Вернуться к основной статье