ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Конформационная подвижность белков по данным различных методов из "Биофизика Т.1" Рассмотренные выше конформационные превращения в белках, установленные методом рентгеноструктурного анализа, относятся к области относительно крупномасштабных макромолекулярных сдвигов, которые отражают суммарный результат более мелких локальных конформационных изменении. Очевидно, в белковой молекуле существует ряд различных конформационных подсостояний, которые быстро возникают в результате короткоживущих возмущений и флуктуаций основной структуры и между которыми быстро устанавливается равновесие. Напомним, что энергия тепловых колебаний 2 к Дж/моль при 300 К сравнима по величине с высотами барьеров на конформационных энергетических картах биополимеров (см. гл. IX). Это является причиной флуктуаций с изменением взаимного расположения атомов, не связанных валентными связями в основной цепи. Так, флуктуации молекулярного объема у молекул с молекулярной массой до 14000 могут при 300 К составить 0,03-0,04 нм , а флуктуации поверхности — до 0,01 нм , т.е. [c.263] Исторически возникновение понятия о конформационной подвижности белков связано с развитием метода изотопного обмена атомов водорода. Явление изотопного обмена состоит в том, что атомы водорода, входящие в основном в амидные пептидные группы, могут вступать в обратимую реакцию обмена с атомами дейтерия и трития, находящимися в окружающем растворителе. К. У. Линдерштрем-Ланг первым обратил внимание на тот факт, что изотопный обмен протекает даже в свернутой компактной конформации белка, но более медленно, чем в рыхлом денатурированном состоянии. Очевидно, недоступные для растворителя пептидные группы могут тем не менее на короткое время экспонироваться в раствор вследствие конформационных переходов типа свертывания - развертывания, которые непрерывно происходят в белковой глобуле. [c.264] Значения констант равновесия К = к+/к-, полученные по изотопному обмену, совпадают с величинами, выведенными из данных по тепловой денатурации, и составляют 10 -10 , а АС 40 60 кДж/моль. Видно, что только около 10 10 части времени нативный белок проводит в денатурированном (развернутом) состоянии. [c.264] Температурная зависимость скорости водородного обмена показывает, что вдали от температуры денатурации реакция обмена характеризуется малыми значениями энергии активации, а вблизи нее — высокими. [c.264] Как известно, поглощение кванта света молекулами переводит их в возбужденное состояние в результате переброски одного электрона на более высокий энергетический уровень. Обратный переход из возбужденного в основное состояние может сопровождаться испусканием кванта света люминесценции. Чаще всего таким фотоэлектроном сложных органических молекул является л-электрон, участвующий в образовании системы делокализованных двойных сопряженных связей молекулы. Сами переходы с поглощением и испусканием света в системе л-электронов представляют соответственно переходы к к и к к между основным и так называемым синглетным возбужденным состоянием. Они соответствуют переходам между связывающими к - и разрыхляющими т1 -орбиталями. [c.265] Запас колебательной энергии молекулы при этом переходе опять возрастает с последующей диссипацией его за 10 -10 с. [c.266] На рис. Х.5 представлена общая схема электронных уровней и переходов между ними (схема Яблонского). [c.268] Рассмотрим систему хромофор — окружаюш ая среда как единую с помош ью диаграммы рис. Х.5. Можно считать, что в случае т — р С т релаксация успевает за время т пройти на нижние ядерные подуровни возбужденного состояния, откуда и высвечивается квант люминесценции. Наоборот, при Тр т высвечивание происходит с верхних колебательных подуровней, что вызывает сдвиг максимума спектра свечения в коротковолновую сторону. В сложной системе (белок), где изменение электронного состояния молекулы-хромофора вызывает реорганизацию его микроокружения, время релаксации среды может быть больше времени жизни электронного возбуждения (тр т ). Этого не наблюдается в отдельных молекулах-хромофорах, где внутримолекулярная колебательная релаксация занимает 10 -10 с, т.е. намного меньше времени т состояний б х жТ. [c.269] Индол триптофана характеризуется большим изменением момента перехода при возбуждении (до АО). Поэтому положение максимума его спектра флуоресценции сильно зависит от подвижности диполей среды и может варьировать до 30 нм. Так как т для 6 -состояния триптофана составляет единицы наносекунд, то по этим данным можно судить о структурных перестройках в белке в наносекунд-ном временном диапазоне. Было показано (Э. А. Бурштейн), что белки обладают характерными двухступенчатыми кривыми зависимости положения спектра флуоресценции от температуры в области от —90 до 0°С. Сдвиги полосы флуоресценции на 4-9 нм в области от —90 до —20°С и на 5-12 нм в области от —20 до 0° (рис. Х.6) свидетельствуют о замораживании движений в белковой матрице в наносекундном диапазоне. Высушенные белки не дают этих спектральных сдвигов, что подчеркивает роль воды как необходимого фактора для появления подвижности белка (см. 4 гл. IX). Очевидно, замораживание быстрой релаксационной подвижности белка имеет кооперативный характер, причем белковые структуры и связанная вода замерзают как единая микрофаза. [c.269] Подобные структурные флуктуации позволяют низкомолекулярным тушителям флуоресценции, в частности кислороду, диффундировать во внутренние области белка, дезактивируя возбужденные состояния. [c.270] Процессы релаксации в системе спинов. Увеличение СВЧ-мощности приводит сначала к увеличению амплитуды резонансного поглощения переменного магнитного поля (сигнал ЭПР), затем достигается некоторая стационарная величина и наступает насыщение. Причина этого связана с взаимодействием системы спинов с их окружением. Это взаимодействие вызывает переориентацию спина и приводит к передаче избыточной магнитной энергии другим степеням свободы, включающим в твердом теле колебания кристаллической решетки. Безызлучательные переходы между двумя состояниями спинов, сопровождающие взаимодействие с окружением, называют спин-решеточной релаксацией. Характеристикой этих процессов является так называемое время спин-решеточной релаксации Ti, которое отражает среднее время жизни данного спинового состояния и является временем достижения теплового равновесия между системой спинов и тепловыми колебаниями решетки. Большие времена Т указывают на малую скорость спин-решеточного взаимодействия. [c.272] На рис. Х.8 приведено изображение линии поглощения СВЧ-поля и ее первой производной, которая обычно регистрируется в ЭНР-спектрометрах и собственно является сигналом ЭНР. [c.273] Спин-решеточная релаксация. Как связан характер взаимодействий в системе спинов с параметрами сигнала ЭНР Из рис. Х.8 видно, что сигнал ЭНР обладает шириной линии поглощения. Это обусловлено тем, что вследствие процессов релаксации состояние спина имеет определенное время жизни, что вызывает уширение резонансного сигнала из-за соотношения неопределенностей для энергии. Согласно этому соотношению, энергия Ео способной к распаду системы, обладающей средним временем жизни т, может быть определена лишь с точностью до величины порядка Н/т (ее обычно называют шириной Г энергетического уровня системы). [c.273] Величина Т сильно зависит от температуры, увеличиваясь при замораживании. Так, сигналы ЭНР парамагнитных ионов металлов часто не наблюдаются при комнатной температуре из-за малой величины Т и, как следствие, слишком большой ширины. Однако при температурах жидкого гелия сигналы регистрируются, так как увеличение Т приводит к сужению линии поглощения и росту ее амплитуды. [c.273] Спин-решеточная релаксация не единственный процесс, определяющий ширину линии. Существует много других процессов, вызывающих изменение относительных энергий спиновых состояний за счет обмена энергией в самой системе спинов. [c.273] Для свободных радикалов Гх Гг, поэтому для них в отсутствие насыш е-ния ширина линии определяется в основном Гг (АН 1/Гг), которое составляет 10 с. Большие величины Гх (секунды, минуты) для органических свободных радикалов связаны с тем, что энергия спинов электронов передается колебаниям ядер решетки через спин-орбитальное взаимодействие, которое для легких ядер весьма мало. Это обусловливает относительно малую скорость процессов спин-решеточной релаксации свободных радикалов. [c.274] Вместо одной резонансной линии от Щ теперь суш ествует набор близко расположенных линий, являюш ихся результатом взаимного влияния спинов друг на друга посредством создания локальных полей. Это влияние сокраш ает время Гг для всей системы спинов, уширяя линию в силу соотношения (Х.2.16). [c.274] При обычных температурах в жидкостях источником уширения линии служат другие эффекты химические реакции, перенос электрона, спиновый обмен, при-водяш ие к изменению магнитного окружения неспаренного электрона. Так, обмен спиновыми состояниями при столкновении частиц в растворе уменьшает время жизни Тг спинов, что увеличивает ширину линии в силу соотношения неопределенностей (Х.2.16). Магнитные моменты ядер, входяш их в состав радикальной частицы. [c.275] Суш ествует два типа взаимодействия электронов и ядер анизотропное и изотропное. Первое из них аналогично классическому взаимодействию двух магнитных диполей и описывается выражением, аналогичным (Х.2.18), в соответствии с которым локальное магнитное поле, создаваемое ядром, зависит от угла 0. [c.275] Вернуться к основной статье