ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Предсказания пространственной организации белков из "Биофизика Т.1" Трехмерная структура белка в обычных физиологических температурных условиях строго центрирована, обладает большой средней плотностью 1,33-1,42 г/см что несколько больше плотности твердого сухого белка и фактически приближается к плотности кристаллов низкомолекулярных органических соединений. Значения удельного объема белковых молекул в растворе приближаются к таковым для сухого белка и немного меньше, чем в случае синтетических полимеров. [c.206] В области строения белка молекулярная биофизика сталкивается с важной проблемой в какой степени уникальность белковой структуры (вторичной и третичной) определяется первичной аминокислотной последовательностью. Эта проблема включает следующие вопросы 1) определяет ли однозначно данная первичная последовательность структуру белковой глобулы при сворачивании цепи, т. е. насколько детерминирован сам процесс укладки белковой цепи в нативную форму 2) возможна ли укладка случайной последовательности остатков в структуру, подобную нативной структуре белка 3) каким образом возникли и были закреплены в ходе эволюции существующие природные первичные последовательности аминокислотных остатков. [c.206] Важность этой проблемы можно иллюстрировать простым расчетом. Известно что число различных белков в природе составляет 10 . Каждый белок содержит около 200 аминокислотных остатков. В этом случае полное число различных последовательностей с 20 разными аминокислотными остатками составит 20 , что неизмеримо больше, чем число белков отобранных природой (20 10 ). Уже в первых работах (Р. Ламри, Г. Эйринг, 1954) было указано на связь между характером аминокислотной последовательности и нативной конформацией белка, обладающей минимальной свободной энергией. Об этом же свидетельствовали и опыты по обратимости перехода белков (рибонуклеаза) из денатурированного состояния в нативную конформацию с восстановлением всех дисульфидных связей. [c.206] В современных исследованиях делают попытки предсказать на основе конкретной аминокислотной последовательности вторичную и третичную структуры белка. Существуют в основном два подхода к решению этой проблемы. [c.206] Как правило, кристаллизация существенно не влияет на конформацию белка, тем более что в белковых кристаллах могут осуществляться многие ферментативные реакции. В глобулярных белках присутствуют полярные неполярные группы в боковых цепях. Общая топография белковой глобулы определяется тем, что на ее поверхности в основном расположены полярные группы, связанные с водой электростатическими и водородными связями, а неполярные группы находятся внутри глобулы и образуют ее гидрофобное ядро (см. 4 этой главы). Внутримолекулярные водородные связи между пептидными группами основной цепи являются важнейшим фактором, стабилизирующим глобулу. Гидрофобные группы образуют целые гидрофобные области на поверхности основных сегментов вторичной структуры а-спиралей и -структур. Тем самым длина каждого структурного сегмента определяется размером гидрофобной поверхности или числом гидрофобных групп, включенных в его состав. [c.207] На рис. IX. 11 приведена схема распределения аминокислотных остатков в а- и Р-участках, обогащенных гидрофобными группами, в то время как соединяющие их изгибы и петли преимущественно содержат короткие полярные группы, заряженные группы, остатки глицина и пролина (О.Б.Нтицьш, В. И. Лим, А. В.Финкель-штейн). В средней части спирали во внутренних ветвях находятся преимущественно гидрофобные остатки (ала, лей). Остатки отрицательными и положительно заряженными боковыми цепями локализуются соответственно на N- и С-концах. [c.207] Па основе простых стереохимических соображений можно видеть, что гидрофобные группы данной а-спирали или -участка включают в промежутках между собой гидрофобные группы других участков, создавая тем самым плотное гидрофобное ядро белка. Последнее экранируется от воды и стабилизируется также длинными гидрофобными группами, расположенными на краях гидрофобной области. Короткие полярные группы, расположенные там же, наоборот, дестабилизируют данный структурный сегмент. [c.208] Дедуктивный метод предсказания вторичной структуры белка дает правильные результаты примерно в половине случаев. 20 рассмотренных таким методом белков (3100 остатков) в а-спиралях содержат 1145 остатков, из них правильно предсказаны 590, неправильно — 555, в -структурах находится 425 остатков, 124 из которых определены правильно. [c.208] Статистические корреляции между первичной и вторичной структурами используют для установления связи между частотами появления тех или иных аминокислот и степенью стабилизации а-спиральных участков. Обширное статистическое исследование структуры белков позволило определить частоту появления каждого остатка в а-спиралях, внутренних витках а-спиралей, -структурах и клубках без учета взаимодействий между остатками. [c.208] Изложенный эмпирический метод основан на экспериментально установленных корреляциях между первичной последовательностью и структурой белка и на представлениях о блочном характере строения белков. Строго говоря, здесь не учитываются в явном виде энергия и механизмы взаимодействия между соседними остатками в основной цепи. Это, в частности, относится и к конформациям боковых цепей, составляющих по числу атомов 2/3 всего белка, для которых недостаточно эмпирических корреляций их структурного положения. В эмпирическом методе ставится на первом этапе задача предсказания в общих чертах модели всего белка с последующим ее уточнением путем минимизации энергии при вариации степеней свободы. Очевидно, дальнейший прогресс на этом пути может быть достигнут при накоплении большого экспериментального материала и соответствующих статистических корреляций между аминокислотной последовательностью и особенностями белковой структуры. Не меньшее значение имеют разработка методов обобщенного топологического описания структур белковых молекул. [c.209] если считать, что в среднем каждый аминокислотный остаток из п их общего числа в белковой цепи обладает 10 низкоэнергетическими формами, то общее число структурных вариантов составляет 10 . Такие расчеты можно выполнить с помощью ЭВМ только для 5-6-членного пептидного фрагмента. Очевидно, единственным правильным путем здесь является поэтапное рассмотрение отдельных видов взаимодействий, определяющих конформацию каждого остатка с ближайшими, соседними и удаленными по цепи остатками. [c.209] Конформационное состояние остатка характеризуется определенными значениями двугранных углов вращения, задающих соответственно низкоэнергетические области на стерических картах. Па следующем этапе учитывают небольшое число низкоэнергетических состояний олигопептидов (трипептид п—1,п,п + 1) на основе известных конформационных состояний составляющих его фрагментов дипептида п — 1, п, п + 1. Расчеты показывают, что взаимодействия остатков в дипептиде приводят к заметной энергетической дифференциации оптимальных форм каждого из них. В то же время наиболее предпочтительные конформации трипептида представляют собой комбинации низкоэнергетических форм смежных дипептидов, что свидетельствует о согласованности три- и дипептидных взаимодействий. [c.210] Конформационный анализ более сложных олигопептидов проводят методом последовательного увеличения цепи на один остаток. Рассчитывают все комбинации, составленные из наиболее выгодных состояний вновь образованной пептидной пары (п -Ь 1, п -Ь 2) и предпочтительных состояний уже рассмотренного фрагмента (п — 1,п,п + 1). Новые взаимодействия, возникающие при удлинении цепи, стабилизируют фрагмент и не нарушают уже сложившихся взаимодействий, что является прямым следствием общей согласованности всех типов взаимодействий. Учет конформационных возможностей свободных фрагментов ведет к идентификации в первичной последовательности жестких структур-нуклеаций, которые стабилизируются дальними взаимодействиями (появление таких нуклеаций предполагают и в эмпирическом подходе). Одновременно с этим под действием средних и дальних взаимодействий образуются и лабильные участки белковой последовательности с определенным набором выгодных конформационных состояний. [c.210] Конкретные расчеты основаны на анализе атом-атомных взаимодействий, включающих невалентные, электростатические, торсионные взаимодействия и водородные связи. В качестве примера рассмотрим данные по изучению пространственного строения и конформационных возможностей фрагмента арг-1 — цис-38 молекулы бычьего панкреатического трипсинового ингибитора (БПТИ), включающей 58 остатков с известной аминокислотной последовательностью (Е. М. Попов). [c.211] Па первом этапе рассчитывали структуры трипептидов ала-25 — ала-27, лей-29 — гли-31 и фен-33 — тир-35, тетрапептида ала-25 — гли-28. Полученные результаты позволили рассчитать конформации фрагментов асм-24 — лей-29, глн-31 — тир-35 и фен-22 — глн-31 (рис. IX. 13). Были выделены наиболее выгодные по энергии состояния, которые использовали при последующем рассмотрении конформационных возможностей более крупных фрагментов. [c.211] Эффективность подобного подхода демонстрирует тот факт, что для гексапептида асм-24— лей-29 из 768 вариантов удалось выделить всего 17 предпочтительных конформаций с относительной энергией в интервале от О до 21 кДж/моль для фрагмента ем-21 — глн-31 из 408 вариантов, полученных после процедуры минимизации в интервал 0-21 кДж/моль, попал лишь один структурный тип, а в интервал до 33,6 кДж/моль—10 типов. Рассмотрение данных структурных типов совместно с фрагментом глн-31 — тир-35 позволило еще более сократить число возможных конформационных состояний для всего фрагмента фен-22 — тир-35, состоящего из 14 остатков (рис. IX. 14). Эти данные использовали в дальнейшем для выбора предпочтительных конформаций при совместном рассмотрении с семью возможными конформациями, полученными ранее при расчете структуры другого фрагмента арг-1 — тир-21. [c.211] Совместное рассмотрение структуры двух указанных фрагментов фен-22 — тир-35 и арг-1 — тир-21 позволило выделить участок антипараллельной -струк-туры, разные направления которой принадлежат разным фрагментам. Дальнейший анализ включал выбор возможных конформационных состояний фрагмента при присоединении трипептидного участка тир-35 — гли-37. [c.212] Сложная задача возникла при согласовании двух рассчитанных фрагментов, поскольку при этом обнаружены стерические препятствия. Еш е более сложные си- туации могут возникнуть при переходе к глобулярным белкам, где число граничаш их блоков должно резко возрасти. Возможно, именно стерические препятствия служат одним из факторов, определяюш их появление у белков гетерогенной по плотности структуры. Для устранения стерических препятствии были использованы вариации двугранных углов у различных остатков. На основе минимизации энергии при вариации двугранных углов удалось устранить все неблагоприятные стерические контакты, оставаясь в пределах низкоэнергетических конформационных карт. Полученная пространственная структура с точностью до 0,1 нм совпала с экспериментально определенной геометрией этого участка. Хорошее совпадение было получено и для 215 двугранных углов. [c.212] Эти данные показывают, что метод полуэмпи-рического конформационного анализа может быть успешно использован для определения пространственной структуры достаточно сложных полипептидов, включаюш их по крайней мере четыре десятка аминокислотных остатков, оставаясь в рамках первоначально отобранных наиболее выгодных конформационных состояний свободных пептидов. Однако при расчете достаточно больших биополимеров приходится накладывать дополнительные ограничения, делая априорные предположения о возможной структуре белка. [c.212] Ограниченность изложенных эмпирических методов предсказания связана с тем, что необходимая информация касается характера только непосредственного окружения аминокислотного остатка и не затрагивает дальних взаимодействий. Можно повысить точность предсказания вторичной структуры до 70%, если проводить сравнительный анализ близких по вторичной структуре последовательностей. [c.212] Вернуться к основной статье