ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы РНК-полимераза из "Ферменты Т.3" Мы рассмотрим здесь два разных, но в своей основе близких процесса. В ходе первого из них, катализируемого ферментом ДНК-полимеразой (КФ 2.7.7.7, но см. с. 407—410), образуется цепочка ДНК из смеси дезоксирибонуклеозидтрифос-фатов на существующей цепи ДНК, играющей роль матрицы, с сохранением данной последовательности нуклеотидов. Этот процесс больще связан с генетикой и передачей генетической информации, чем с биосинтезом ферментов. [c.12] Вопрос об идентификации фермента, реплицирующего ДНК в клетке, служил предметом живой полемики. В Номенклатуре ферментов, опубликованной в 1972 г. [1266], под кодовым номером 2.7.7.7 значится одна ДНК-полимераза, и в настоящее время этот фермент известен как ДНК-полимераза I. Однако было показано, что у бактерий имеются четыре разные ДНК-поли-меразы эти ферменты были разделены и очищены. В течение примерно десяти лет, начиная с 1959 г., полагали, что ДНК-полимераза I, свойства которой рассмотрены в обзоре Корн-берга и др. [1257], является ферментом, ответственным за биосинтез ДНК. Но позже стало ясно, что активность этого фермента недостаточна, чтобы обеспечить наблюдаемую скорость биосинтеза более того, было обнаружено, что мутант Е. oli, у которого этот фермент отсутствует, синтезирует ДНК с нормальной скоростью [1048, 1687]. [c.13] Обе полимеразы используют в качестве матрицы ДНК, необычная двухцепочечная ДНК, как и следовало ожидать, неактивна, поскольку пуриновые и пиримидиновые основания скрыты в глубине двойной спирали. Одна из цепей может стать матрицей лишь в том случае, если цепи разойдутся хотя бы на небольшом участке (см. ниже). [c.14] Возможно, неспособность полимеразы II в отличие от полимеразы I осуществлять репликацию ДНК с разрывами объясняется тем, что последняя обладает также 5 -нуклеазной активностью, которая отсутствует у полимеразы И, и это дает возможность полимеразе I увеличивать размер пробела до величины, при которой последний может стать стартовой площадкой для синтеза. Важно отметить, что все ДНК-полимеразы способны использовать в качестве матрицы ДНК, содержащие пробелы в одной цени. [c.15] Очевидно, что полимеразы могут инициировать синтез новых цепей только при наличии (в дополнение к матричной цепи) затравки, т. е. полинуклеотида (который может быть коротким), функционирующего как акцептор нуклеотидов в ферментативной реакции. Таким образом, можно сказать, что новая цепь образуется на конце затравки и сбоку от матрицы. На рис. 11.3 длинная цепь является матрицей, а короткая — затравкой это может быть либо одноцепочечная матрица с добавленной затравкой, либо двухцепочечная ДНК с пробелом в одной цепи, где З -конец разорванной цепи будет служить-затравкой. [c.15] Таким образом, очищенная полимераза III обладает характерными свойствами, присущими биологически активному ДНК-реплицирующему ферменту. Имеется, однако, одно исключение она не может самостоятельно копировать очень длинные цепи ДНК, для этого необходимо присутствие дополнительных факторов. Было выделено два белковых фактора, которые при добавлении к очищенной полимеразе III позволяют ей быстро копировать очень длинные молекулы ДНК и очень длинные искусственные полидезоксирибонуклеотидные матрицы. Механизм их действия еще изучается данные о состоянии вопроса на 1975 г. суммированы в работе [1517], с. 59—61. [c.16] Вторая трудность состоит в том, что при копировании двух-цепочечной ДНК две матричные цепи прочитываются в противоположных направлениях (одна от З -конца к 5 -концу, а другая—от 5 -конца к З -концу), в то время как все полимеразы считывают свои матрицы с З -конца и все попытки найти ДНК-полимеразу, действующую в обратном направлении, не дали результатов. То, что одна цепь ДНК должна считываться в неправильном направлении, вытекает уже из того факта, что при образовании двух двухцепочечных молекул из одной процесс протекает с одного конца исходной молекулы ДНК ДО другого, а две цепи этой молекулы имеют противоположное направление. Это же явление имеет место в случае репликации кольцевых хромосом бактерий каждый цикл начинается в определенной точке (начало репликации) и продолжается в обе стороны, причем две репликативные вилки встречаются в точке, диаметрально противоположной точке старта [413]. Это может происходить только в том случае, если половина каждой цепи считывается в неправильном направлении. [c.17] Механизм репликации хромосомной двухцепочечнои ДНК далеко не ясен. Этот процесс, протекающий в живых клетках, чрезвычайно сложен и имеет ряд особенностей, которые пока еще не объяснены. Можно только пытаться создавать модели, согласующиеся с полученными данными и с известными свой-.ствами ферментов. [c.18] в которой две исходные цепи ДНК разделяются и в которой присоединяется ДНК-полимераза, перемещается вдоль молекулы ДНК от одного конца к другому, оставляя позади себя две двойные спирали, каждая из которых образовалась из исходной цепи (одноцепочечная матрица) и вновь синтезированной цепи. Такие репликативные вилки хорошо видны на электронных микрофотографиях. [c.18] Однако объяснение копирования ДНК как единого непрерывного процесса, протекающего от одного конца молекулы до другого, сталкивается с двумя основными трудностями. Первая состоит в том, что при расплетании двухцепочечной молекулы такой огромной длины, содержащей, возможно, сто миллионов витков, возникают практически непреодолимые меха- Нические препятствия, если только в ходе процесса не будут созданы некоторые специальные условия. Такие условия создаются при образовании разрывов в одной из цепей перед движущейся репликативной вилкой, поскольку одиночная цепь может вращаться вокруг своей оси, в то время как в двойной спирали такого вращения происходить не может в пользу образования разрывов получены убедительные данные. Разрывы могут быть затем ликвидированы благодаря действию ДНК-лигаз после заполнения пробелов с помощью полимераз. [c.18] что в настоящее время все теории репликации ДНК следует рассматривать как сугубо рабочие и, вероятно, они будут изменяться с учетом новых данных, которые удается получить в ходе многочисленных проводящихся в настоящее время исследований. [c.19] Иногда а-фактор начинает транскрипцию только при участии сАМР, соединенного со специальным белком. Это относится к синтезу мРНК для нескольких групп ферментов, участвующих в метаболизме ряда сахаров у Е. oli. Биосинтез этих ферментов ингибируется глюкозой, которая снижает количество образующегося сАМР [4096]. [c.19] На рис. 11.4 изображена схема, иллюстрирующая идею процесса. Здесь две исходные цепи ДНК, а и Ь, реплицируются в направлении справа налево, и репликативная вилка, у вершины которой они разделяются, перемещается влево. Новая цепь на матрице а строится в правильном направлении и поэтому направлена внутрь вилки, где родительские цепи разделяются. Очевидно, что по мере расплетания очередного участка двойной спирали увеличивается длина одноцепочечного участка цепи Ь, и когда эта длина становится достаточно большой (или когда поступает сигнал), начинается копирование цепи Ь, которое будет протекать слева направо, по направлению к уже образованному участку 2. Таким образом, хотя участки копируются на матрице в порядке 1, 2, 3, они считываются с З -конца матрицы к 5 -концу. [c.20] Эта идея прерывистого копирования ДНК подтверждается данными о том, что первичный продукт репликации состоит в основном из фрагментов разной длины, в среднем содержащих, 1000 нуклеотидов и известных как фрагменты Оказаки [3524]. Эти фрагменты затем соединяются в правильном порядке. Учитывая свойства полимеразы I, можно полагать, что она играет важную роль в процессе копирования исходных фрагментов, а соединение их осуществляется, вероятно, поли-дезоксирпбонуклеотидсинтетазой (АТР) (КФ 6.5.1.1). [c.20] Данные о непрерывном копировании одной цепи ДНК и прерывистом копировании другой получены не только на бактериях например, они подтверждаются исследованием процесса репликации ДНК бактериофага 0X174 [1219] однако имеются данные и о прерывистом копировании обеих цепей [655]. [c.20] Теории репликации ДНК должны учитывать открытие Суд-жино и Оказаки [4564], показавших, что фрагменты Оказаки начинаются на 5 -конце фрагментом РНК, состоящим из 50— 100 нуклеотидов, и только затем следуют фрагменты ДНК-Другими словами, для начала синтеза цепи ДНК требуется РНК-затравка, на конце цепи которой и строится ДНК- В процессе формирования цепи ДНК фрагмент РНК удаляется специфическим ферментом рибонуклеазой Н (КФ 3.1.26,4) [2400], и фрагмент ДНК встраивается в новую цепь. [c.20] Вернуться к основной статье