ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Аминокислоты из "Биологическая химия" Молекулярный вес низкомолекулярных веществ можно определить по понижению температуры замерзания их растворов (методом криоскопии), по повышению его точки кипения или изменению плотности пара. Однако эти методы оказались непригодными для определения молекулярного веса белков, так как при нагревании большинство белков свертывается и выпадает в осадок. Определение молекулярного веса белков по понижению температуры замерзания их растворов хотя и воз.можно, но не дает достаточно точных результатов. Из сказанного ясно, что для определения молекулярного веса белков необходимо использовать другие методы. Первые определения молекулярного веса белков были основаны на химическом анализе л елеза или серы. Классическим примером такого способа может служить определенно молекулярного веса гемоглобина по содержанию в нем железа. Первоначально полученная этим методом величина 16 500, представляющая минимальный молекулярный вес гемоглобина, долгое время рассматривалась как истинный молекулярный вес. Позднее другим путем было установлено, что истинный молекулярный вес гемоглобина в растворе составляет 66 ООО, из чего можно заключить, что каждая молекула гемоглобина в действительности состоит из четырех более мелких единиц, или, как сейчас называют, субъединиц. Молекулярный вес субъединиц и был определен по содержанию в них железа. [c.13] В дальнейшем для определения молекулярного веса белков использовались физико-химические методы по осмотическому давлению, по скорости седиментации в ультрацентрифуге, рентгеновским анализом и др. В настоящее время определение молекулярного веса белков проводят почти исключительно путем измерения скорости оседания их в ультрацентрифуге, в которой при 80 ООО и более оборотов в минуту образуется огромная центробежная сила. Скорость оседания белков зависит от веса и формы частицы, а также от температуры результаты измерения обычно относят к 20°С и отмечают это следующим образом Боо- Такое определение молекулярного веса с помощью центрифуги было ВЕелеко Сведбергом. [c.13] Простейшим способом расщепления белковой молекулы на ее структурные элементы является гидролиз. [c.13] Гидролиз белка можно проводить и при помощи протеолити-ческих ферментов. Ферментативный гидролиз особенно ценен в тех случаях, когда требуется получить промел уточные белковые компоненты — пептиды. [c.14] Аминокислоты могут быть легко выделены из гидролизатов в кристаллическом виде или в виде их солей. При полном гидролизе большинства белков обычно получаются смеси 19—20 различных оптически активных а-амииокислот. [c.14] При неполном гидролизе крупная молекула белка распадается на более мелкие фрагменты, которые в настоящее время и служат основным материалом для изучения первичной структуры. [c.14] В последнее десятилетие при изучении химического строения белка все более широко применяются физико-химические методы разделения смесей аминокислот электрофорез, обменная адсорбция, хроматографическая адсорбция, распределительная хроматография, а также энзиматические и микробиологические методы. Благодаря этому облегчено выделение ряда аминокислот и некоторые прежние химические способы утратили свое значение. [c.14] Остановимся кратко на одном из наиболее распространенных способов разделения аминокислот — на методе хроматографии. [c.14] Метод хроматографического анализа основан на неодинаковой способности различных соединений, в том числе пигментов, адсорбироваться на тех или иных адсорбентах. [c.15] На рисунке 4 показано разделение пигментов на колонке по М. С. Цвету. [c.15] В применяемых видах хроматографического анализа можно выделить три большие группы распределительная хроматография адсорбционная хроматография (молекулярная, ионообменная адсорбция) осадочная хроматография. Последняя не нашла еще применения для разделения аминокислот. [c.15] Распределительная хроматография на бумаге. Это наиболее эффективный из существующих в настоящее время способов качественного и количественного анализа состава биохимических объектов исследования. [c.15] В основе его лежит принцип многократного повторения элементарных актов распределения между двумя фазами, из которых одна остается неподвижной (водная фаза, сорбированная бумагой), а другая, неводная (органический растворитель), движется по ее поверхности. Разделение в этом случае происходит за счет различий в коэффициентах распределения веществ между фазами. В качестве подвижной фазы чаще всего используются насыщенные водой фенолы, нормальный бутиловый спирт в смеси с уксусной кислотой, амиловый спирт, пиридин, коллидин, лютидин и другие органические растворители. Само разделение проводится в двух формах одномерной и двухмерной хроматографии. [c.15] Так как аминокислоты не могут двигаться впереди фронта растворителя, то Я/, естественно, всегда меньше единицы. [c.17] При двухмерной хроматографии разделяемую смесь аминокислот наносят на один из углов листа фильтровальной бумаги в 5—7 см от обоих ее краев. Конец листа погружают на 12—24 ч в насыщенный водой фенол, а после высушивания бумаги на воздухе лист поворачивают и другой (прилегающий к нанесенному пятну) край листа погружают еще на 12—24 ч в коллидин, смесь пиридина (2-пиколина) и хинолина или другую смесь. Дальнейшее проявление производится так, как описано выше. На двухмерной хроматограмме разделяются те пятна, кото-рые на одномерной не разделились являются еще смесями нескольких минокисл от. При строгом соблюде- НИИ соответствующих условий до-Тч стигается полное разделение всех аминокислот (рис. 6). [c.17] В 1949 г. Штейн и Мур разработали метод хроматографического разделения аминокислот, позволяющий получать все аминокислоты с выходом 99—99,5% общего содержания аминокислот в белке. [c.17] В настоящее время во многих лабораториях имеются автоматизированные приборы-анализаторы, действие которых основано на сочетании метода ионообменной хроматографии со спектро-фотометрией. Эти приборы, напоминающие по размерам и форме небольшой шкаф, способны осуществить менее чем за 24 ч непрерывной работы полный качественный и количественный анализ сложной смеси аминокислот, получающейся при гидролизе белка. [c.17] В некоторых белках отдельные аминокислоты отсутствуют или содержатся в незначительных количествах, а в других их мол ет быть много. [c.18] По наличию в молекуле амнногрупп и карбоксильных групп аминокислоты разделяются на монокарбоновые аминокислоты (одна аминогруппа и одна карбоксильная группа) моноамино-дикарбоновые аминокислоты (одна аминогруппа и две карбоксильные группы) диаминомонокарбоновые аминокислоты (две аминогруппы и одна карбоксильная группа). [c.20] Для аминокислот таким стандартом обычно служит а-амино-кислота -серин, содержащийся во всех белках. [c.20] Вернуться к основной статье