ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Активный центр ферментов Е. И. Филиппович из "Химия биологически активных природных соединений" Ферменты являются очень лабильными, легко инактивируемыми соединениями. Этим и объясняется специфичность методов выделения и очистки белков-ферментов. [c.198] Первыми ферментами полученными в кристаллическом виде, были уреаза (выделенная в 1926 г. Самнером) и пепсин (выделенный Нортропом в 1929 г.). Самнер и Нортроп получали ферменты в кристаллическом состоянии путем высаживания их из растворов сульфатом аммония, спиртом, ацетоном и другими химическими реагентами. В последние годы благодаря использованию новых эффективных методов очистки ферментов (электрофорез, ионообменная хроматография, противоточное распределение, гель-фильтрация) и модернизации уже известных методов их выделения и очистки удалось получить сотни химически однородных кристаллических препаратов ферментов. [c.199] Одной какой-то определенной схемы выделения и очистки ферментов не существует. В каждом отдельном случае приходится прибегать к сочетанию различных способов. [c.199] Все операции по выделению и очистке ферментов проводят в условиях, исключающих возможность денатурации. Эти условия — низкая температура, строгое ограничение продолжительности операции, контроль за pH, отсутствие примесей солей тяжелых металлов и других соединений, которые могут привести к денатурации фермента. [c.199] Ферменты находятся в живой клетке либо в межклеточной жидкости — цитоплазме, либо в структурных образованиях клетки — ядре, оболочке, микросомах, митохондриях и др. Клеточные и субклеточные (для митохондрий) мембраны непроницаемы для молекул ферментов. Поэтому для извлечения внутриклеточных ферментов надо сначала разрушить клеточные структуры. Разрушение клеточных структур осуществляют различными механическими способами (измельчение в гомогенизаторе, перемалывание со стеклянными шариками, песком, кизельгуром, твердыми нейтральными солями), многократным замораживанием и оттаиванием, обработкой органическими растворителями (этиловым спиртом, бутиловым спиртом, ацетоном, глицерином, этилацетатом). В отдельных случаях для разрушения особо прочных клеток используют действие высокочастотных звуковых и ультразвуковых колебаний. [c.199] После разрушения клеток или тканей ферменты извлекают путем экстракции водой, буферными растворами или растворами нейтральных солей, а иногда и разбавленными растворами субстратов, стабилизирующих выделяемый фермент. В получаемом экстракте кроме ферментов содержится большое количество неактивных белков и ряд других соединений, для полного удаления которых требуется сочетание различных методов. Для удаления низкомолекулярных веществ экстракт диализуют против воды или разбавленных буферных растворов. Во многих случаях диализ заменяют гель-фильтрацией через сефадекс. [c.199] Сефадокс представляет собой полисахарид декстран, цепи которого соединены поперечными связями, образуя молекулярное сито . Чем больше поперечных сшивок, тем меньше размеры ячеек молекулярного сита . Молекулы небольших размеров диффундируют внутрь набухших гранул, а крупные белковые молекулы проходят сквозь колонку. Следует отметить, что при гель-фильтрации на сефадексах может происходить и частичное фракционирование белков. [c.199] Балластные белки обычно осаждают одним из известных методов фракционирования — избирательной денатурацией. Если фермент устойчив к нагреванию (например, рибонуклеаза выдерживает нагревание до 90° С без инактивации), проводят термическую денатурацию инертных белков, нагревая экстракт определенное время при 50—70° С. Применяют также кислотную денатурацию (подкисляют экстракт до pH 5 или ниже), если выделяемый фермент не инактивируется при данном pH используют и обработку экстракта хлороформом или смесью хлороформа и спирта. Денатурированные балластные белки отделяют от фермента центрифугированием или фильтрацией, а затем из водного раствора путем дробного осаждения (в основе которого лежит различная растворимость белков-ферментов) выделяют фракцию, обладающую наибольшей ферментативной активностью. [c.200] Многие препараты ферментов были получены в гомогенном и кристаллическом состоянии классическим методом солевого фракционирования, основанным на способности белков высаливаться из концентрированных растворов нейтральных солей (сульфатов аммония, натрия, магния, ацетата натрия или фосфата калия) при определенной температуре. Чаще всего пользуются сульфатом аммония, который отличается весьма хорошей растворимостью, мало изменяющейся при понижении температуры. При строго контролируемых значениях температуры и pH солевым фракционированием можно добиться довольно тонкого разделения. Неорганические соли после солевого фракционирования удаляют из растворов ферментов диализом или гель-фильтрацией. [c.200] Часто при выделении и очистке ферментов используют уменьшение растворимости белка-фермента при pH, близком к изоэлектрической точке. [c.200] Для дробного осаждения можно применять и органические растворители (ацетон, метиловый спирт, этиловый спирт, диоксан), которые уменьшают количество гидратной воды, связанной с ферментом, и вызывают его осаждение. Поскольку ферменты в присутствии органических растворителей легко инактивируются, такое фракционирование проводят при низких температурах. [c.200] При очистке ферментов от сопутствующих белков используют также метод избирательной адсорбции — либо в объеме , добавляя к раствору фермента определенное количество адсорбента, либо на колонке. В качестве адсорбентов применяют главным образом каолин, гидроксилапатит [Са5(Р04)д0Н] и др. Избирательная адсорбция ферментов может осуществляться двумя путями адсорбент может связывать неактивные белки, оставляя фермент в растворе, или же сорбируется фермент, а в растворе остаются неактивные белки. Адсорбцию обычно проводят при 0° С. Адсорбированный фермент элюируют с предварительно промытого водой или буфером адсорбента ацетатными, фосфатными или боратными буферами. [c.200] Ферменты, устойчивые к денатурирующему действию органических растворителей, фракционируют с помощью распределительной хроматографии и противоточного распределения. [c.200] Для ионообменной хроматографии ферментов наиболее широкое применение в качестве носителей нашли карбоксиметилцеллюлоза и диэтиламиноэтилцеллюлоза. При проведении ионообменной хроматографии необходимо учитывать, что при определенных значениях pH раствора и концентрации электролитов возможна инактивация ферментов. [c.201] Электрофорез используется для выделения и разделения ферментов на конечных стадиях очистки, а также для препаративных и аналитических целей. Для препаративного выделения и очистки ферментов проводят зонный электрофорез па бумаге и в блоках или на колонках с различными наполнителями (целлюлозным порошком, крахмалом и другими), а также электрофорез в гелях — агар-агаровом, крахмальном, полиакриламидном. Электрофорез в гелях отличается от электрофореза на порошкообразных или пористых носителях. Здесь сочетаются два метода разделения ферментов — электрофоретический и метод, основанный на гель-фильтрации. Фракционирование ферментов на основе различной электрофоретической подвижности оказывается одним из самых эффективных методов. [c.201] На последней стадии очистки, когда фермент очищен настолько, что он является преобладающим компонентом в растворе, проводится кристаллизация. В концентрированный раствор фермента (в концентрации, близкой к насыщению) постепенно вводят осадитель, выпавшие кристаллы отделяют. В качестве осадителей используют нейтральные соли (сульфат аммония, магния) или органические растворители (этанол, ацетон). Кристаллизация ускоряется при внесении затравки — небольшого количества того же фермента. Повторяют кристаллизацию до тех пор, пока активность полученных препаратов не перестанет повышаться. [c.201] Концентрирование растворов ферментов осуществляют обдуванием раствора, находящегося в целлофановом мешочке, током воздуха от вентилятора или ультрацентрифугированием. Растворы ферментов концентрируют также в вакуум-эксикаторах в присутствии водоотнимающих средств. При этом происходит повышение концентрации солей, что может привести к денатурации ферментов. [c.201] Очищенный раствор фермента или кристаллический препарат может быть высушен путем замораживания и сублимации льда при низкой температуре и глубоком вакууме (лиофилизация), что позволяет избежать денатурации. [c.201] Контроль за выделением и очисткой ферментов на отдельных стадиях проводится с помощью определения активности фермента различными методами. [c.201] По мере очистки активность фермента возрастает и достигает определенного максимального значения, характерного для однородного фермента. Постоянство активности при перекристаллизации также является критерием гомогенности фермента. [c.202] Вернуться к основной статье