ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Селективное расщепление молекулы на фрагменты из "Химия биологически активных природных соединений" После установления природы и числа аминокислот, входящих в состав молекулы белка, и определения С- и N-кoицeвыx аминокислот необходимо установить последовательность расположения аминокислот по длине цепи. В настоящее время непосредственное определение длинных последовательностей аминокислот еще лежит за пределами возможностей методов, которые имеются на вооружении химии белка. Поэтому общий подход к решению этой задачи заключается в том, что белковую цепь предварительно разрушают на ряд фрагментов, каждый из которых затем исследуют различными методами деградацией по Эдману, действием карбокси- или аминопептидаз и др. [c.79] Чтобы по фрагментам можно было установить первоначальную аминокислотную последовательность, необходимо иметь в распоряжении такие способы фрагментации, которые, во-первых, будут однозначно разрывать молекулу в определенных местах и, во-вторых, давать разные наборы фрагментов из одной и той же последовательности. [c.79] Первое из этих условий — однозначность или специфичность — является желательным в связи с тем, что для дальнейшего исследования требуется количественно выделить отдельные куски молекулы, отдельные пептиды. При хаотическом, ненаправленном разрушении всей последовательности это сделать весьма трудно. [c.79] Соблюдение второго условия также имеет принципиальное значение, так как, даже зная последовательность аминокислот в каждом фрагменте, невозможно определить всю последовательность, потому что неизвестно, как эти фрагменты были расположены в исходной молекуле. Решить этот вопрос помогает одновременное рассмотрение фрагментов, полученных разными способами из одной и той же молекулы. [c.79] Методы расщепления делятся на ферментативные и химические. [c.79] При действии трипсина такой белок специфически разрушается лишь вблизи остатков аргинина, давая небольшое число крупных пептидов. Аналогичный результат может быть получен после обработки белка сероуглеродом . [c.81] Пепсин, папаин, термолизин могли бы в данном случае заменить трипсин и химотрипсин, однако они имеют гораздо меньшую специфичность. [c.81] Химическое расщепление. При гидролизе белков кислотами в мягких условиях (37° С, несколько часов) происходит лишь частичное разрушение пептидных связей. Известно, что к концу гидролиза в гидролизате обычно накапливается значительное количество дипептидов. Однако путем подбора времени гидролиза и концентрации кислоты можно добиться образования возможно менее сложной смеси пептидов. [c.81] Превращение остатка цистеина в дегидроаланин было использовано при изучении рибонуклеазы. Полностью восстановленная панкреатическая рибонуклеаза содержит 8 остатков цистеина в молекуле. Соколовский и Патчорник использовали следующий ряд реакций, позволивший им количественно разорвать молекулу рибонуклеазы на 9 фрагментов. [c.82] Выделение и исследование фрагментов. Расщепление на фрагменты — лишь половина задачи при установлении аминокислотной последовательности. Не менее трудоемкой и сложной является вторая часть работы, а именно анализ смесей полученных пептидов, выделение их в индивидуальном состоянии и установление структуры каждого из них. [c.83] Первую информацию о составе пептидной смеси и характере полученных фрагментов (без выделения пептидов в чистом виде) даст использование двумерного фракционирования на бумаге сочетание высоковольтного электрофореза в одном направлении и хроматографии в другом направлении, двумерная бумажная хроматография, двумерный электрофорез и др. На рис. 14 приведен пример такого разделения смеси пептидных фрагментов, образовавшихся при гидролизе трипсином лизоцима белка яиц. В качестве стандартов с / = 1 были использованы феноловый красный и аргинин. [c.83] Принцип двумерного фракционирования лег в основу так называемого метода отпечатков пальцев Сущность метода состоит в том, что сравниваемые белки гидролизуют ферментами в одинаковых условиях и гидролизаты подвергают двумерному фракционированию на бумаге. [c.83] Метод отпечатков пальцев является, но-видимому, весьма перспективным и находит все большее применение в генетических исследованиях на молекулярном уровне а также для решения вопроса о видовой специфичности белков. Однако следует отметить, что этот метод дает лишь предварительные данные и при сравнении двух белков требуется тщательное воспроизведение условий эксперимента. [c.83] Если необходимо точное определение аминокислотной последовательности, смесь пептидов после предварительного анализа подвергают препаративному разделению, главным образом при помощи ионообменно хроматографии и бумажного электрофореза Достоинство ионообменной хроматографии — высокая разрешающая способность, преимущество бумажного электрофореза — простота выполнения и малая затрата времени. Кроме того, для разделения пептидов частичных гидролизатов используют противоточное распределение и бумажную хроматографию. [c.83] Каждый из выделенных пептидов затем изучают в отдельности. Для исследования аминокислотной последовательности наиболее удобны небольшие пептиды, содержащие от четырех до шести аминокислотных остатков. Для них легко установить N- и С-концевые аминокислоты, а также, применив деградацию по Эдману или гидролиз карбоксипептидазой А, определить всю последовательность. Крупные фрагменты после определения концевых остатков и аминокислотного состава обычно расщепляют дополнительным гидролизом на более мелкие части. [c.84] Предложено также использовать К-метилированные производные пептидов. При этом образуются более летучие вещества, что позволяет анализировать с помощью масс-спектрометрии 12—15-членные пептиды Крупным достоинством метода является быстрота проведения анализа (несколько часов) и малые количества вещества (10 мкг). [c.85] Вид масс-спектра одного из синтетических пептидов приведен на рис. 16. Следует отметить, что при расшифровке масс-спектров пептидов существенное значение приобретает точное знание характера фрагментации боковых цепей отдельных аминокислотных остатков, особенно таких сложных, как аргинин, гистидин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты и их амиды, цистин и цистеин. [c.87] Большой вклад в разработку этого метода внесли К. Биман, Е. Ле-дерер а также М. М. Шемякин, Н. С. Вульфсон, Ю. А. Овчинников Применение масс-спектрометрии уже сейчас создает возможность упрощения всего процесса расшифровки аминокислотных последовательностей, начиная со стадии изучения структуры фрагментов. В будущем, вероятно, станет возможным прямое масс-спектрометрическое изучение высокомолекулярных белков. [c.87] Воссоздание всей последовательности по фрагментам известной структуры. Из пептидных фрагментов с расшифрованной структурой мысленно складывают исходную полипептидную цепь. Ход такого воссоздания целого из различных частей можно видеть на довольно простом примере установления структуры -меланофорстимулирующего гормона гипофиза свиньи Этот пептидный гормон разрушается химотрипсином на четыре пептидных фрагмента. Трипсин гидролизует его с образованием трех пептидных фрагментов. После установления аминокислотной последовательности всех этих пептидов можно легко выявить перекрывающиеся пептиды из триптического и химотриптического гидролизатов и найти всю последовательность (см. стр. 86). [c.87] Вернуться к основной статье