ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Выделение белков из "Химия биологически активных природных соединений" Выделение нативных белков из природных, источников — сложный и трудоемкий процесс. Это обусловлено лабильностью белков, малыми различиями физико-химических свойств отдельных компонентов белковых смесей и способностью белков давать комплексы с липидами, углеводами, нуклеиновыми кислотами и другими веществами, входящими в состав клетки. [c.18] Серьезной проблемой является извлечение нужного белка из смесей близкородственных белков, содержащихся в экстрактах тканей и биологических жидкостях. [c.19] Наиболее распространенным методом разделения (фракционирования) белков ранее являлось высаливание — осаждение нужных фракций путем постепенного увеличения концентрации неорганической соли в растворе при оптимальном pH. Проведение высаливания не требует специального оборудования, кроме того, в растворах солей устойчивость белков увеличивается. Для этих целей наиболее часто используется сульфат аммония поскольку он хорошо растворим в воде и легко дает растворы большой ионной силы. [c.19] Однако методом высаливания невозможно получать высокоочищенные препараты индивидуальных белков. Выделяемые белки, как правило, представляют собой смеси близких по физико-химическим свойствам белков. Гораздо более эффективными оказались хроматографические методы выделения белков, в первую очередь ионообменная хроматография и гель-фильтрация, а также электрофорез. Однако и до сих пор, особенно на первых стадиях очистки белковых смесей, кроме хроматографических методов используют такие приемы, как осаждение солями, органическими растворителями при низкой температуре и осаждение путем изменения pH. [c.19] Смесь белков в буферном растворе наносят на колонку с ионообмен-ннком. Затем сорбированные белки вытесняют в порядке увеличивающейся устойчивости связи с ионитом, пропуская через колонку буферные растворы с различными pH или разной ионной силой. [c.20] Многокомпонентные смеси фракционируют с помощью градиентной элю-цип, которая заключается в том, что pH или концентрация элюента меняются непрерывно по определенному закону. Таким способом осуществлена, например, очистка тиреогло-булина свиньи — белкового гормона, регулирующего деятельность надпочечников, который был выделен путем экстракции измельченной щитовидной железы растворами хлористого натрия. Фракционированием полученного экстракта на ДЭАЭ-целлюлозе (рис. 6) удалось отделить главный компонент смеси — тиреоглобулин (пик 3) от белковых (пики 1, 2, 4, 5) и небелковых (пики и 7 2) примесей. [c.20] Наряду с ионообменной хроматографией для разделения белков широко применяют зонный электрофорез, основанный на различной подвижности заряженных белковых молекул в поле постоянного тока. Обычно деление происходит при прохождепии тока через буферный раствор, содержащий смесь белков, причем используется как электрофорез в растворе так и электрофорез на носителях. Для быстрого предварительного анализа белковой смеси удобен бумажный электрофорез В препаративных целях используют электрофорез в блоке В качестве носителя в этом случае можно применять крахмал, стеклянный и целлюлозный порошки, поливинилхлорид. Наибольшей разрешающей способностью для белков обладает электрофорез в геле По-видимому, здесь играет роль не только заряд частиц, но и их величина, т. е. гель действует и как опорная среда, и как молекулярное сито. Наряду с крахмальным используют агар-агаровый и полиакриламидный гели. [c.20] Для белков разработан метод электрофореза на колонках с градиентом плотности раствора который сочетает прехгмущества электрофореза в растворе с высокой разрешающей способностью электрофореза в опорных средах. [c.21] Справа — результат электрофоретического анализа фракций фракции, содержащие чистый церулоилазмцн, выделены штриховкой. [c.22] Гомогенность белка всегда требуется доказать несколькими методами. [c.22] С помощью перечисленных выше методов в последнее время выделены в индивидуальном состоянии сотни биологически важных клеточных белков. Например, совсем недавно получены в чистом виде белки интер-фероны, которые являются сильнейшими антивирусными агентами Очистку этих белков проводили на сефадексе 0-100, а их гомогенность определяли методом ультрацентрифугирования. [c.22] В водных растворах молекулы белка гидратированы. Такая связанная вода составляет иногда до 30—50% собственной массы белковой молекулы. При добавлении солей пли органических растворителей, смешивающихся с водой, степень гидратации снижается, белковые молекулы ассоциируют и выпадают из раствора в осадок вместе со значительным количеством связанной воды. В дистиллированной воде растворяется ограниченное количество белков. Большинство белков переходит в раствор при добавлении солей, реже — кислот или оснований. С ростом концентрации соли может, однако, проявиться эффект высаливания, и белок снова переходит в осадок. [c.23] Так как а-амино- и -карбоксильные группы всех аминокислот, входящих в состав белка, кроме концевых, участвуют в образовании пептидных связей, то на поведение молекулы белка в растворе наибольшее влияние оказывает способность к диссоциации функциональных групп в боковых цепях аминокислот (см. стр. 28). Если pH среды, в которой находятся молекулы белка, имеет такую величину, что число положительно заря-7кенных групп в молекуле равно числу групп, заряженных отрицательно, то говорят, что белок находится в изоэлектрической точке (см. стр. 36). Если молекулы белка в этих условиях поместить в поле постоянного тока, то они не будут двигаться ни к катоду, ни к аноду. В изоэлектрической точке белок имеет, как правило, наименьшую растворимость и склонен к ассоциации. Так, ацетилхолинэстераза — фермент, гидролизующий ацетилхолин, имеет изоэлектрическую точку при pH 5,1, причем растворимость фермента в этих условиях уменьшается в несколько раз рис. 8). [c.23] Денатурация может быть обратимой и необратимой. Известно, что если белок денатурирует в концентрированном растворе мочевины (8 М), то после диализа его первоначальные свойства, как правило, восстанавливаются. Напротив, тепловая денатурация является необратимым процессом. Любая денатурация сопровождается потерей биологическо активности белка. Большинство исследователей считают, что денатурация связана с дезорганизацией пространственной структуры белковых цепей (вторичной и третичной структуры). Это подтверждается появлением в белке после денатурации ранее скрытых функциональных группировок SH, ОН, NHg (см. раздел Пространственная структура белков ). [c.24] Вернуться к основной статье