ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Техника введения в культуру in vitro и культивирование изолированных клеток и тканей растений из "Сельскохозяйственная биотехнология Изд2" Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности. Богатая питательная среда является прекрасным субстратом для развития в ней микроорганизмов, а изолированные от растения фрагменты (экспланты), которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами. Поэтому надо стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (лами-нар-боксе) стерильными инструментами. Стерильность надо соблюдать и во время культивирования изолированных тканей, особенно при перепаде температуры и влажности, так как при этом пробки становятся влажными и по ним в пробирку могут проникать микроорганизмы. [c.80] Стерилизацию экспланта и семян проводят выдерживая их 5—20 мин в стерилизующих растворах с последующей многократной промывкой экспланта стерильной водой. Время стерилизации зависит от характера экспланта и от стерилизующей активности раствора. Семена стерилизуют 10—20 мин, а вегетативные части 5—10 мин. Примеры стерилизующих растворов приведены в табл. 3.1. [c.80] Органы растений, из которых берут эксплант для введения в культуру, предварительно моют щеткой в мыльном растворе и споласкивают дистиллированной водой, а затем погружают на несколько секунд в 70%-ный этанол. Семена погружают в спирт на 1—2 мин. Кроме собственно стерилизующего действия спирта обработка тканей этанолом перед помещением в основной стерилизующий раствор повышает стерилизующий эффект последнего. [c.80] После стерилизации растительные объекты должны быть тщательно промыты стерильной водой. [c.81] Поверхностная стерилизация освобождает эксплант только от наружной инфекции. Если же ткани экспланта имеют внутреннюю инфекцию, то его необходимо обработать антибиотиками. Особенно богаты внутренней инфекцией ткани тропических и субтропических растений с крупными сосудами. Загрязнение культур грибами или бактериями обычно выявляется через 1—14 дней после посадки. Загрязненные культуры необходимо тотчас же удалить, чтобы избежать заражения воздуха в световой комнате. [c.81] Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С и давлении 0,75—1 атм в течение 20 мин. Если в состав питательной среды входят вещества, разрушающиеся при высокой температуре, их подвергают холодной стерилизации, пропуская через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,22—0,45 мкм, после чего добавляют в проавтокла-вированную охлажденную до 40°С основную среду. [c.81] Посуду, предварительно завернутую в фольгу или оберточную бумагу, стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при 160 С в течение двух часов. [c.81] Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также витамины, углеводы, фитогормоны или их синтетические аналоги. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для клеток. [c.81] Для получения каллусной ткани в отдельных случаях к питательной среде добавляют жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана и др. [c.81] Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей, так как в большинстве случаев последние не способны к автотрофному питанию. Чаще всего в качестве углевода используют сахарозу или глюкозу в концентрации 2—3 %. [c.81] Фитогормоны необходимы для дедифференцировки клеток и для индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред должны обязательно входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины, индуцирующие деление клеток. В случае индукции стеблевого морфогенеза содержание ауксинов в среде может быть снижено или они могут быть полностью исключены из питательной среды. [c.81] На безгормональной среде растут опухолевые и привыкшие ткани. Автономность по отношению к обоим гормонам или к одному из них связана со способностью этих клеток синтезировать гормоны. [c.82] В качестве источников ауксинов в питательных средах используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), индолил-З-уксусную кислоту (ИУК), а-нафтилуксусную кислоту (НУК). Для получения рыхлого хорошо растущего каллуса чаще применяют 2,4-Д, так как ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. [c.82] В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используют кинетин, 6-бензиламинрпурин (БАП), зеатин. 6-БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза по сравнению с кинетином. В состав некоторых сред входит аденин. [c.82] В настоящее время известно большое число различных по составу питательных сред, но наиболее часто применяемая при выращивании изолированных растительных тканей в условиях in vitro среда Т. Мурасига и Ф. Ску га, впервые составленная в 1962 г. Эта среда содержит хорошо сбалансированный состав питательных веществ и отличается от других, как правило, соотношением аммонийного и нитратного азота (табл. 3.2). [c.82] Для приготовления твердых питательных сред используют агар-агар, который представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. [c.82] С целью рационального использования времени растворы солей мак-ро- и микроэлементов, а также витаминов и фитогормонов готовят более концентрированными, что позволяет многократно их использовать. Концентрированные (маточные) растворы хранят в холодильнике. [c.82] Условия культивирования. Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные условия выращивания. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеют хлоропластов и питаются гетеротрофно. Исключение составляют некоторые зеленые каллусные ткани, такие, как каллусная ткань мандрагоры. В некоторых случаях каллусные ткани, не способные к автотрофному питанию, все же выращивают на непрерывном освещении, что является необходимым условием дальнейшего успешного морфогенеза, как у люцерны. Большинство же каллусных тканей получают в темноте или при рассеянном свете. [c.82] Детерминированные к морфогенезу ткани переносят на свет и далее культивируют их при освещенности 1000—4000 лк. [c.82] Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей 25— 26 С, для культуры тканей тропических растений она может достигать 29—30°С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18—20 С. [c.83] Вернуться к основной статье