ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Число жизнеспособных клеОбщее число клеток из "Биология Том2 Изд3" При анализе роста бактерий или дрожжей мы можем либо непосредственно подсчитывать число клеток, либо измерять некоторые параметры, зависимые от числа клеток, например мутность раствора или вьщеление газа. Обычно небольшое количество микроорганизмов засевают в стерильную питательную среду и выращивают культуру в инкубаторе при оптимальной температуре роста. Остальные условия должны быть как можно более близкими к оптимальным (разд. 12.1). Рост следует измерять от момента инокуляции. [c.53] Определить число клеток можно двумя способами, а именно, подсчитывая либо число жизнеспособных клеток, либо общее число клеток. Число жизнеспособных клеток — это число только живых клеток. Общее число клеток — это суммарное число как живых, так и мертвых клеток обьгано этот показатель определить легче. [c.53] Иногда важно знать число жизнеспособных клеток. Например, можно оценить эффективность гибели определенных бактерий при пастеризации молока, измеряя количество жизнеспособных бактерий до и после пастеризации. В промышленном производстве только живые клетки участвуют в процессе, поэтому и здесь важно знать число живых клеток в культуре. Количество жизнеспособных клеток можно подсчитывать на чашках, где культура распределена по поверхности агара или внесена в агар число жизнеспособных клеток дрожжей можно подсчитывать, используя метод гемоци-тометрии. [c.53] Этот метод был уже описан в разд. 12.4.1 (рис. 12.5). Небольшой известный объем культуры наносят на поверхность питательного агара в чашке Петри. Недостатком этого метода является то, что часть культуры остается на поверхности шпателя и в пипетке, поэтому невозможно подсчитать число клеток с высокой точностью. Однако часто это бывает не важно. [c.53] При условии, что проба содержит не слишком много и не слишком мало бактерий, число колоний можно легко подсчитать, причем для предосторожности лучше не открывать крышку чашки Петри при подсчете. Обычно требуется приготовить серии разведений, так чтобы в одной из серий оказалось идеальное число колоний. Серии разведений — это серии последовательных равномерных разбавлений одного образца (рис. 12.9). Когда найдено подходяшее разведение, эксперимент повторяют при данном разведении для повышения точности и воспроизводимости результатов. В эксперименте 12.3 из разд. 12.9.2 число бактерий в пробах молока было установлено с использованием этого метода. Некоторые ограничения метода обсуждаются в конце данного раздела. [c.54] Этот метод уже был описан в разд. 12.4.1 (рис. 12.6). Принципиально он не отличается от посева на поверхность агара, но в данном случае пробу смешивают с питательным агаром перед заливкой чашек, так что колонии распределяются по всему объему среды, а не растут только по поверхности. [c.54] Подсчет жизнеспособных клеток дрожжей можно проводить с помощью гемоцитометра и метиленового синего. Этот метод более детально описан в следующем разделе. [c.54] С подсчетом жизнеспособных клеток связан ряд проблем. [c.54] Число бактериальных или дрожжевых клеток в жидкой культуре, например в бульоне, можно прямо подсчитать с помошью микроскопа. Этот метод удобен для подсчета дрожжевых клеток, которые гораздо крупнее бактериальных. При подсчете бактерий необходим объектив с иммерсионным маслом (см. разд. 5.11.2). [c.54] Обычно для подсчета используют особое предметное стекло, называемое гемощггометром (рис. 12.10), а сам метод известен как гемоцито-метрия. Чтобы обеспечить прочный контакт между предметным стеклом и покровным стеклом, следует сильно придавить покровное стекло с любой стороны камеры (но так, чтобы не раздавить покровное стекло ). Затем покровное стекло слегка сдвигают до тех пор, пока не покажутся цветные линии (рис. 12.10). Проба жидкости, наносимая пипеткой, затягивается под покровное стекло за счет капиллярного эффекта. Камеру оставляют на 2—3 мин, чтобы клетки осели — это облегчает подсчет. Микроскоп фокусируют на решетке и подсчитывают число клеток на всей решетке, или на ее репрезентативном участке. Нужно насчитать не менее 600 клеток. Если клетки лежат на границе, их можно отнести к квадрату, ограниченному двумя сторонами (например, верхней и правой границами), и не считать их в квадрате, офаниченном двумя другими сторонами, но не следует пытаться считать половинки клеток. Каждый маленький квадрат имеет известную плошадь, а глубина жидкости под покровным стеклом является постоянной (обычно 0,02 или 0,1 мм). Следовательно, можно вычислить объем каждой ячейки, и подсчитать число клеток в данном объеме. Если число клеток в каждом квадрате превышает 30, следует развести пробу. Не забывайте при расчетах сделать поправку на разведение. [c.55] При подсчете клеток дрожжей можно использовать краситель метиленовый синий. При этом в синий цвет окрашиваются только мертвые клетки. Живые клетки активно вьшодят краситель из клетки. Таким образом, можно подсчитать число жизнеспособных клеток, если учитьшать только бесцветные или бледно-голубые клетки. [c.55] Можно также мутность измерять как долю пропускания света (или оптическую плотность) суспензией с использованием колориметра или спектрофотометра. Клеточная масса прямо пропорциональна оптической плотности. Лучше всего использовать красный свет (красный фильтр), поскольку он не интерферирует с желтоватым цветом многих культуральных сред. [c.56] При измерении мутности возможны ошибки, если растущие клетки образуют комки (см. раздел, посвященный подсчету жизнеспособных клеток). Наиболее точные результаты получают в тех случаях, когда плотность популяции не слишком высокая и не слишком низкая. Для получения идеальной плотности клеток (10 — -10 ° клеток см ) иногда требуется разведение проб. [c.56] Вернуться к основной статье