ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Меры предосторожности, которые необходимо соблюдать для предупреждения изменений белковых веществ из "Белки Том 1" Молекула белка состоит из одной или более полипептидных цепей (см. статью III настоящего тома и статью II т. II). Основой для изучения структуры белковой молекулы являются данные о количестве каждого из аминокислотных остатков, последовательности их расположения в каждой из пептидных цепей (которые могут быть, а могут и не быть одинаковыми), а также о пространственном строении молекулы, обусловленном складыванием или свертыванием полипептидных цепей и их положением по отношению друг к другу. Биологические, химические и физические свойства белка определяются структурой белковой молекулы в целом. Эти свойства зависят, часто в значительной степени, от наличия в молекуле небелковых частиц, более или менее прочно связанных с полипептидными цепями. [c.7] Поскольку незначительные вариации в строении белковой молекулы ведут к изменению ее свойств, важно избегать таких изменений или контролировать их в процессе выделения белка. Такие модификации могут происходить а) благодаря химическим реакциям, в ходе которых разрушаются некоторые ковалентные связи в молекуле, б) вследствие изменения водородных и соле-выхчсвязей, обусловливающих трехмерную структуру молекулы, в) в результате изменения характера соединения с другими белковыми или небелковыми веществами, связанными с данным белком. Как было уже указано выше, изменения последнего типа необязательно должны сопровождаться изменениями самой белковой молекулы. Для процессов выделения белка такие изменения могут и не иметь особого значения, хотя они в конечном счете должны быть приняты во внимание, особенно при исследовании клеточных структур. При выделении неизмененных нативных белков следует избегать причин, обусловливающих изменения и относящихся к первым двум типам. Степень важности различных структурных изменений, а также устойчивость белков по отношению к факторам, вызывающим такие изменения, неодинаковы при переходе от одного белка к другому (см. статью VI т. II). Однако если нет специальных указаний, то лучше пользоваться, там где это возможно, только такими методами, о которых известно, что они обусловливают наименьшие изменения в структуре молекулы. [c.8] Денатурацией обычно считают всякую модификацию структуры белковой молекулы, которая приводит к заметным изменениям ее свойств. Исключение составляют модификации, обусловленные изменением состава белка или разрушением его кова-лентных связей, например при гидролизе самих пептидных цепей. Негидролитические модификации могут быть вызваны рядом причин (см. статью VI т. II), которые обычно вызывают глубокие изменения в свойствах, в том числе и потерю биологической ак-. тивности. [c.8] Тепловая стабильность белков варьирует в широких пределах. Известно, что некоторые белки устойчивы по отношению к высоким температурам и даже к кипячению [14]. Результаты этих наблюдений иногда использовались для отделения при помощи тепловой денатурации стабильных белков от менее устойчивых [14, 15]. Такие методы, однако, следует применять с осторожностью, имея необходимые экспериментальные доказательства того, что выделенный белок после термической обработки остается неизмененным (см. стр. 77). [c.9] Выделение белка при низких температурах имеет еще и то преимущество, что в этих условиях задерживается рост микроорганизмов, а также замедляется действие гидролизующих ферментов, которые могут присутствовать в реакционной смеси. [c.9] Обычно следует также избегать крайних значений рН. Большинство белков устойчиво только в относительно узких пределах рН и быстро денатурируется при подкислении или подщелачива-нии растворов. Значение рН, при котором белок максимально устойчив, наиболее близко к значению рН нейтрального раствора и необязательно совпадает с изоэлектрической точкой белка. Установлено, например, что альбумин плазмы, изоэлектрическая точка которого лежит при рН около 4,6, наиболее стабилен к нагреванию при рН 6,8 [16]. Известны, однако, исключения пепсин, например, более стабилен при рН около 5 и разрушается при нейтральном рН [14]. [c.9] Многие белки быстро денатурируются в присутствии таких растворимых в воде органических растворителей, как этиловый спирт или ацетон. Поэтому при использовании их для фракционирования белков следует соблюдать особую осторожность (2) и поддерживать как можно более низкую температуру [ITJ. Тем не менее многие белки вполне устойчивы в растворах глицерина. [c.9] Следует обратить внимание на денатурирующее действие поверхностей, пленок и, особенно, пен. На поверхности водного раствора или на поверхности раздела белки стремятся образовать пленку из денатурированных молекул. Если пленки денатурированного белка постоянно снимать с поверхности, то денатурация будет продолжаться с образованием новых пленок [20]. В том случае, когда образуется пена, денатурация принимает весьма существенные размеры и при работе с разбавленными растворами может охватить значительную часть всего белка. Исходя из этого рекомендуется применять концентрированные растворы, чтобы избежать возникновения больших поверхностей белковых растворов и, особенно, пенообразования. Время от времени полезно добавлять антипенообразователи, что, однако, не всегда устраняет поверхностную денатурацию [21]. [c.10] Давно известно, что большинство белков более устойчиво в концентрированных растворах, чем в разбавленных [9]. Методы концентрирования белковых растворов описаны ниже (стр. 33). Разбавленные растворы нейтральных солей также повышают стабильность белков даже в разбавленных растворах последних [9]. Другие специальные. способы стабилизации приведены ниже (стр. 39). [c.10] Поскольку стабильность различных белков даже в одной и той же смеси может значительно изменяться, является очевидным, что в каждом отдельном случае выделения белка следует учитывать его индивидуальные особенности и принимать необходимые меры предосторожности. [c.10] Микроорганизмы необходимо удалять из белковых растворов, поскольку они либо изменяют белки, либо усложняют смеси за счет введения дополнительных компонентов. Линдерштрём-Ланг описал изменение очищенного белка, овальбумина, ферментом бактериального происхождения [24] (стр. 39). [c.11] В случае сложных белков необходимо принимать специальные меры предосторожности, зависящие от природы небелковых веществ и от связи, которой эти последние соединены с белком. Изучая нуклеопротеиды, следует соблюдать осторожность для того, чтобы не утратить части нуклеиновой кислоты (если предметом исследования является не один белок, а весь нуклеопро-теид в целом) [25]. Оказалось, что липопротеиды чувствительны к замораживанию [26]. Простетические группы иных типов могу г подвергаться химическим [27] или ферментативным воздействиям [23], приводящим, с одной стороны, к изменению специфических биологических свойств сложных белков и, с другой стороны, к изменению растворимости или других свойств этих соединений. Так, известно, что изменение степени окисления простетической группы гемоглобина приводит к значительным изменениям его растворимости [27]. [c.11] Вернуться к основной статье