ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Разделение, качественное и количественное определение аминокислот из "Основы аналитической химии Кн 3 Издание 2" Разделение сложной смеси аминокислот на составные части основано на различии коэффициентов распределения аминокислот в двух несмешивающихся растворителях. Для качественного анализа хроматограмму проявляют и определяют содержащиеся в растворе аминокислоты путем подбора свидетелей или расчета коэффициента Rf. [c.329] Для количественного анализа проводят определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски или размерам пятен хроматограмм, а также путем элюирования аминокислот из отдельных пятен и последующего определения их классическими количественными методами анализа. [c.329] Если пятна на хроматограмме перекрываются или по какой-либо причине контуры их искажаются, то данный метод не может быть использован для количественного определения. [c.329] Подготовка бумаги. Для разделения аминокислот используют бумагу для хроматографии 1 и 2. Бумагу тщательно отмывают 0,3 н. раствором НС1, затем 0,5 н. раствором щелочи, избыток NaOH отмывают дистиллированной водой до отрицательной реакции по фенолфталеину, обрабатывают 0,1%-ным фосфатным буферным раствором (pH = 7,0—7,5) и высушивают. [c.329] Предварительная обработка может быть исключена, если бумага не содержит ионов тяжелых металлов. [c.330] Растворитель. н-Бутиловый спирт — уксусная кислота — вода (4 1 5). Смесь встряхивают 1—2 мин и после расслаивания отделяют слои. [c.330] Проявитель — 0,2%-ный раствор нингидрина в безводном ацетоне (200 мг нингидрина растворяют в 100 мл чистого ацетона). Хранят проявитель в сосуде из темного стекла. [c.330] Для приближения условий построения калибровочного графика к условиям анализа исследуемой пробы, что значительно повышает точность анализа, поступают следующим образом в 10 мл воды или 10%-ного изопропилового спирта растворяют кроме определяемой аминокислоты еще несколько аминокислот, кислоты выбирают с таким расчетом, чтобы их пятна не перекрывались иа хроматограмме при однократном пропускании растворителя. [c.330] Растворы для исследования. Для разделения берут еле-дующие смеси аминокислот 1) гистидин, глицин, валин, изолейцин (или лейцин) 2) аргинин, глутаминовая кислота, аланин, метионин 3) лизин, серии, тирозин, фенилаланин 4) цистин, аспарагиновая кислота, тирозин, пролин, триптофан. [c.330] После окончания разделения хроматограмму высушивают на воздухе и проявляют, для этого ее опрыскивают из пульверизатора 0,2%-ным раствором нингидрина в ацетоне. Затем нагревают 15—20 мин при 60 °С в термостате или сушильном шкафу. Расположение аминокислот сверху вниз по направлению движения растворителя следующее цистин, лизин, аргинин, гистидин, аспарагиновая кислота, серии (три последние аминокислоты располагаются в виде тесно сближенных пятен) глутаминовая кислота, треонин, аланин, пролин, тирозин, валин, метионин, триптофан, фенилаланин, лейцин, изолейцин (последние три аминокислоты также часто располагаются в виде тесно сближенных пятен). Для того чтобы сохранить пятна на хроматограмме, их фиксируют 1%-ным раствором нитрата меди в ацетоне, погружая хроматограмму в этот раствор или опрыскивая ее из пульверизатора. После фиксации пятна приобретают красно-оранжевую окраску. [c.331] Качественный состав аминокислот в исследуемом растворе определяют путем сопоставления положения пятен известных веществ — свидетелей — с положением пятен, полученных для анализируемого раствора. [c.331] Коэффициент определяют для каждой аминокислоты (см. рис. 116). Одна и та же аминокислота при одних и тех же условиях опыта имеет постоянное значение По полученным значениям / / можно в последующих опытах определить качественный состав смеси аминокислот без применения свидетелей . [c.331] Подготовка бумаги — см. стр. 329 растворитель — см. стр. 330 проявитель — 0,5%-ный раствор нингидрина, который готовят растворением нингидрина в ацетоне, ледяной уксусной кислоте и воде (95 1 4) непосредственно перед определением. [c.331] Калибровочный график. Для построения калибровочных графиков готовят 0,01 М растворы аминокислот. Навески аминокислот, необходимые для приготовления 10,0 мл 0,01 М растворов, приведены выше (см. табл. 16). [c.331] С помощью микропипетки наносят на бумагу 5, 10, 15 и 20 мкл стандартного раствора порциями по 5 мкл с таким расчетом, чтобы каждая точка будущего калибровочного графика соответствовала 0,05 0,10 0,15 и 0,20 мкг аминокислоты. [c.331] Растворитель пропускают через бумагу столько раз, сколько это необходимо для четкого разделения аминокислот исследуемой пробы. Хроматограмму затем высушивают, проявляют, погружая на несколько секунд в 0,5%-ный раствор нингидрина, снова подсушивают в течение нескольких минут на воздухе и нагревают для развития окраски (15 мин) в сушильном шкафу при 60 °С. [c.331] Контуры пятен стандартных растворов на хроматограмме осторожно очерчивают карандашом и определяют их площади планиметром. Затем строят калибровочный график в координатах натуральные логарифмы площадей пятен — концентрация аминокислот. [c.331] Вместо площади можно определять массу пятна, для этого пятно вырезают и взвешивают. На основании полученных данных строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс натуральные логарифмы концентраций, а на оси ординат — массу пятен. [c.332] Для достаточной точности проводят 6—10 параллельных определений как для стандартных растворов, так и для каждой аминокислоты неизвестной концентрации. В этом случае точность метода определяется правильно найденными границами пятен и выбранными концентрациями, при которых наблюдается линейная зависимость между площадью (массой) пятна и 1п С. [c.332] За истинный объем пипетки (У) принимают среднее арифметическое всех определений. Объем микропипетки должен быть не больше 2—5 мкл. [c.332] Вернуться к основной статье