ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Анализ аминокислот в растворе методом распределительной хроматографии на бумаге из "Практикум по хроматографическому анализу" Цель работы разделение аминокислот при одновременном их присутствии в растворе методом распределительной хроматографии на бумаге с последующим их качественным и количественным определением. [c.109] Качественное и количественное определение аминокислот проводят после их разделения методом хроматографии на бумаге. Разделение основано на различии в скорости перемещения по бумаге компонентов хроматографируемой смеси с растворителем. [c.109] Количественное определение может быть проведено различными способами. Наиболее распространенным является способ с предварительным построением калибровочного графика в координатах площадь пятна — концентрация. Калибровочные кривые используют для количественного определения той же аминокислоты, содержащейся в исследуемой смеси (рис. 38). [c.109] Часто используют экстрагирование вещества из пятен на бумаге с последующим определением концентрации фотоколориметрическим методом и построением соответствующего графика. [c.109] Подготовка бумаги. Для разделения аминокислот используют бумагу для хроматографии 1 или 2, предварительно обработанную раствором 8-оксихинолина или раствором трилона Б для удаления следов катионов металлов. Листы бумаги, соответствующие по размеру хроматографической камере, помещают в 0,1 %-ный раствор 8-оксихинолина (раствор 0,1 г 8-оксихинолина в 100 мл смеси, состоящей из н-бутилового спирта, ледяной уксусной кислоты и воды в объемном соотношении 4 1 1). Через 1—2 мин бумагу вынимают, подсушивают, помещают в хроматографическую камеру для нисходящей хроматографии, закрепляют один конец в кювете с подвижным растворителем — смесью н-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды (4 1 5 по объему). [c.110] Растворитель пропускают по бумаге сверху вниз до полного удаления темноокрашенных оксихинолятов (36—48 ч). Промытую бумагу сушат на воздухе, а затем в вытяжном шкафу. [c.110] Бумагу можно промыть также 1 %-ным водным раствором трилона Б, для чего бумагу помещают в раствор трилона Б, затем вынимают, переносят в хроматографическую камеру или кювету с двойным дном (верхнее перфорированное, нижнее целое) и с отводной трубкой для отсасывания воды и воздуха водоструйным насосом и тщательно промывают дистиллированной водой. [c.110] Отмытую бумагу высушивают на воздухе в течение нескольких часов, так как следы трилона Б и 8-оксихинолина могут помешать количественному определению аминокислот. [c.110] Кроме описанных способов рекомендуется перед анализом аминокислот, аминов и белков подвергать бумагу следующей обработке. Бумагу тщательно отмывают 0,3 н. раствором НС1, затем нейтрализуют кислоту 0,5 н. раствором щелочи, избыток NaOH отмывают дистиллированной водой до отрицательной реакции иа фенолфталеин, обрабатывают 0,1 %-ным фосфатным буфером с pH 7,0—7,5 и высушивают. Если бумага не содержит ионов тяжелых металлов, то ее можно не подвергать предварительной обработке. [c.110] Растворитель 2. (н-Бутиловый спирт — муравьиная кислота — вода в соотношении по объему 75 15 10). [c.111] Растворитель 3. (Водонасыщенный 80%-ный фенол). Растворитель готовят смешиванием 80 мл разогретого на водяной бане перегнанного фенола с 20 мл дистиллированной воды. Чтобы фенол не окислялся при хранении и не темнел, перегонку ведут следующим способом. К 88 г расплавленного фенола добавляют 12 мл воды, 100 мг алюминиевых стружек и 50 мг ЫаНСОз. Смесь помещают в колбу Вюрца и перегоняют фенол при атмосферном давлении. Собирают фракцию, кипящую при 185° С, которую и применяют в качестве растворителя. [c.111] При хранении растворителей, приготовленных смешиванием бутилового спирта и уксусной кислоты, возможно образование бутилацетата, что вызывает расслаивание растворителя. Этот растворитель не пригоден для работы. [c.111] Чаще всего используют первый растворитель. [c.111] Проявитель 1. Для проявления аминокислот употребляют 0,2%-ный раствор нингидрина в безводном ацетоне (200 мг нингидрина растворяют в 100 мл чистого ацетона). Хранят проявитель в темном сосуде. [c.111] Проявитель 2. Для проявления аминокислот при их содержании ниже 1 мкг рекомендуется 0,4%-ный раствор нингидрина в смеси н-бутилового спирта и фенола (19 1 по объему). [c.111] Приготовление растворов аминокислот свидетелей . [c.111] В качестве свидетелей применяют 0,01 М растворы различных чистых аминокислот. Навески аминокислот (табл. 4) отвешивают на аналитических весах и растворяют в воде или 10%-ном изопропиловом спирте. Раствор тирозина подкисляют 0,1 н. раствором НС1 до его полного растворения. [c.111] Остальные аминокислоты при одновременном их присутствии в растворе полностью не разделяются. [c.112] После трехкратного пропускания растворителя полоску бумаги высушивают на воздухе и проявляют хроматограмму раствором нингидрина, опрыскивая из пульверизатора. Проявленную хроматограмму прогревают 15— 20 мин при 60° С в термостате или сушильном шкафу. [c.113] При использовании в качестве растворителя смеси н-бутанола, уксусной кислоты и воды (4 1 5) расположение аминокислот по направлению движения растворителя (сверху вниз) следующее цистин, лизин, аргинин, гистидин, аспарагиновая кислота, серин (три последние аминокислоты имеют вид тесно сближенных пятен) глутаминовая кислота, треонин, аланин, пролин, тирозин, валин, метионин, триптофан, фенилаланин, лейцин, изолейцин (последние три аминокислоты часто имеют вид тесно сближенных пятен). [c.113] Вернуться к основной статье