ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Кажущееся ингибирование продуктами в реакциях ферментативной деградации полимерных субстратов из "Ферментативный катализ" Выявление таких данных получило название картирование активного центра фермента. [c.38] Методологическая основа обоих подходов состоит а) в изучении влияния степени полимеризации субстрата на кинетические параметры ферментативной реакции б) в количественном анализе химического состава продуктов ферментативной деполимеризации, для чего в качестве субстратов используют линейные олигосахариды, меченные С по концевой восстанавливающей группе. [c.39] Оба метода применимы лишь для простых гидролитических реакций, протекающих по схеме (5), и имеют свои преимущества и недостатки. Однако на практике реакция часто усложняется а) трансгликозилированием б) конденсацией (что может быть частным случаем трансгликозилирования) в) множественной атакой (существование последней во многих случаях проблематично, см. следующую главу). Дело в том, что двухсубстратные процессы (трансгликозилирование, конденсация) или множественная атака могут не только влиять на кинетику деполимеризации, но и заметно изменять распределение продуктов реакции по составу олигомеров и тем самым приводить к ложным выводам о структуре активного центра и особенностях его действия. [c.39] Следует также отметить, что при проведении картирования активного центра ферментов необходимо использовать деполимеразы чистые если не в физическом, то хотя бы в функциональном отношении. Даже малейшие примеси, присутствующие в ферментных препаратах, предназначенных для картирования активного центра, могут значительно исказить результаты эксперимента. Далее, для проведения исследований следует располагать серией структурно-гомологичных олигомерных субстратов с последовательно изменяющейся длиной цепи (предпочтительно от степени полимеризации п, равной двум-трем, до п, равной или превышающей число сайтов в активном центре фермента, обычна до семидевяти. Субстраты должны быть также гомогенными по хроматографическим показателям [5]. [c.39] Основным допущением для вывода соотнощений (13) и (14) является предположение об аддитивности сродства сайтов в активном центре. Иначе говоря, принимается, что сродство (аффинность) мономерного звена к любому сайту не зависит от того, заняты ли другие сайты (все илн некоторые), и аффинность протяженных фрагментов ( 1) к соответствующим сайтам равна сумме соответствующих аффинностей звеньев к отдельным сайтам. Это весьма сильное (и неочевидное). допущение далее специально обсуждается. [c.41] При получении соотношений (17) и (18) делается еще одно допущение (также неочевидное), что о здесь принимается в качестве характеристической константы, величина которой не зависит от степени полимеризации субстрата или от конкретной позиции субстрата (и расщепляемой связи) в активном центре фермента. Иначе говоря, величина ко по гипотезе Хироми задается только химическим механизмом ферментативной реакции, ио не вторичной специфичностью фермепт-субстратного взаимодействия. [c.42] Здесь уместно указать, что если ко не есть характеристическая константа и увеличивается с ростом длины цепи субстрата, то величина сродства А , определяемая с помощью соотношения (20), окажется завышеннон. [c.43] что необходимым условием использования данного подхода яв./ яется подчинение кинетики ферментативного гидролиза уравнению Михаэлиса- Ментен. Отклонения от этого уравнения, вызванные такими эффектами, как трансглюкозилирование, ингибирование или активация субстратом, различная pH- или температурная зависимость скоростей гидролиза используемых пар субстратов будут искажать левую часть соотношения (20) п, следовательно, приведут к неверным показателям сродства сайтов активного центра к мономерным остаткам субстрата. [c.43] Для конкретного случая, представленного на рис. 6, отношение константы скорости псевдопервого порядка образования меченого димера из тетрамера к константе скорости образования меченого мономера из тримера (левая часть выражения 24) позволяет определить сродство четвертого по счету сайта активного центра фермента (рис. 6, а). [c.45] Это позволяет определить сродство первого по счету сайта активного центра фермента (рис. 6,6). [c.45] Таким образом, последовательно варьируя пары субстратов (различающиеся по длине на один мономерный остаток) и регистрируя все возможные меченые продукты гидролиза, можно определить сродство всех сайтов активного центра, за исключением двух, прилегающих слева и справа к каталитическому участку, Аг и Л,+ . [c.45] многократное использование различных пар субстратов и сопоставление их реакционной способности дает возможность определить число сайтов, положение каталитического участка в активном центре и сродство большинства сайтов к мономерным звеньям субстрата. [c.49] По этому поводу Тома и Аллен [15] резонно заметили, что продуктивная ассоциация субстрата с ферментом может доминировать над непродуктивной даже при относительно малой степени полимеризации субстрата по сравнению с протяженностью активного центра, когда по каким-либо причинам связывание субстрата происходит в основном с вовлечением каталитического участка активного центра. В таком случае положение излома на кривой зависимости типа log/екат от п будет соответствовать лишь нижнему пределу числа сайтов. Иначе говоря, число сайтов в активном центре может существенно превышать число мономерных остатков субстрата, при котором величина кат достигает предела. [c.49] ЛИ мальтоолигосахариды, меченные по восстанавливающему концу. При изучении фермента из штамма ВЬА-О были использованы немеченые субстраты, но в этом случае, как правило, невозможно заключить, от какого конца субстрата—восстанавливающего или невосстанавливающего— произошло отщепление фрагментов с относительно низкой степенью полимеризации. [c.52] Полагая, по своей обычной методике, что гидролитический коэффициент ко для расщепления субстрата, связанного с ферментом продуктивно (т. е. с участием каталитического центра), не зависит от степени полимеризации субстрата и степени заполнения сайтов активного центра, Хироми принял, что величина соответствует плато, достигаемому каталитическими константами скоростей гидролиза при последовательном возрастании степени полимеризации субстрата (/го=Ь10 мин ) [8]. Далее, используя выражения (13) и (19) и численное значение константы скорости второго порядка гидролиза мальтозы, продуктивное связывание которой должно происходить с участием сайтов 6 и 7, прилегающих с двух сторон к каталитическому участку, Хироми рассчитал суммарное сродство этих сайтов, равное —3,1 ккал/моль. [c.52] Из этого примера видно, что при картировании активного центра не следует ограничиваться измерением кинетических параметров ферментативного гидролиза, а надо также проводить измерения относительных частот расщепления связей при использовании меченых олигомерных субстратов. [c.54] Л) — Л4 = J97 1п 240 = 3,2 ккал/моль. [c.55] Поскольку Л4 = 5,2 ккал/моль, то Л = 8,4 ккал/моль (табл. 11). [c.55] Вернуться к основной статье