ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Электрофорез белков из "Химия и биология белков" Движение границы между белком и буфером в средней части кюветы можно наблюдать непосредственно только в том случае, если испытуемый белковый раствор окрашен, как, например, растворы гемоглобина или гемоцианина. Для регистрации движения неокрашенных белков была использована фотография в ультрафиолете (известно, что все белки поглощают ультрафиолетовый свет). Это потребовало замены стеклянных кювет кварцевыми. [c.89] Затруднения, связанные с невозможностью видеть границу, в конце концов были преодолены при помощи остроумного метода. [c.89] В силу более высокого показателя преломления белкового слоя свет, проходя через границу, отклонится в направлении белкового раствора, т. е. вниз. При соответствующем оптическом устройстве разница в преломлении может быть обнаружена в виде тени на матовом экране или па фотографической пластинке. Появление темных полос, вызванное различиями в преломлении, называют явлением Тёплера. Так как показатель преломления пропорционален концентрации белка, то угол отклонения светового потока, проходящего через границу, с увеличением концентрации белка будет возрастать. [c.90] Из сказанного ясно, что ширина темной полосы (фиг. 14 и 15) зависит от положения диафрагмы, которая отсекает оклоненный свет (фиг. 14). Чем выше поднята диафрагма, тем шире будет темная полоса. [c.92] Однако значительная ширина этой полосы препятствует точному определению положения границы. С другой стороны, границы с более низким градиентом преломления могут быть обнаружены только при более высоком положении диафрагмы, и, чтобы уловить их, необходимо поднять диафрагму (фиг. 14). В электрофоретическом аппарате Лонгсворта движение диафрагмы вверх сочетается с движением фотографической пластинки 4 в сторону, в результате чего вместо серии отдельных снимков получается непрерывная электрофоретическая диаграмма (фиг. 16) . [c.92] Раствор, содержащий только один вид белка, образует одну темную полосу если же раствор содержит два или более вида белков с различной подвижностью, то по ходу электрофореза выявятся соответственно две или более полос. В последнем случае единая граница наблюдается лишь в момент времени = О, т. е. до включения тока. Под влиянием постоянного тока различные белки будут двигаться с различной скоростью, в связи с чем возникнет несколько зон изменяющегося преломления. Единственная темная полоса, представленная на фиг. 16, заменится в этом случае несколькими горизонтальными темными полосами. [c.93] Наиболее часто исследуются электрофоретически смеси белков нормальной и патологической сывороток крови. Диаграммы восходящей и нисходящей границ обычно изображают в горизонтальном положении, т. е. повернутыми на 90°. Восходящая и нисходящая диаграммы представляют зеркальное изображение одна другой, но все же небольшие различия между ними всегда имеются. Обычно приводят только нисходящую границу (фиг. 17). [c.93] При pH 7,35, присущем нормальной сыворотке крови, а также при более высоких значениях pH, все белки сыворотки представляют собой анионы и, следовательно, движутся в одном и том же направлении, указанном стрелкой на фиг. 17. Сывороточный альбумин, изоэлектрическая точка которого лежит при pH 4,6, движется к аноду с наибольшей скоростью, в то время как глобулины, изоэлектрические точки которых лежат между pH 5 и 6, перемещаются с меньшими скоростями. Максимумы на кривой, изображенной на фиг. 17, указывают положение отдельных границ в момент, когда был сделан снимок. Высота кривой определяется градиентом преломления, т. е. величиной йп1йк, в то время как площадь, заключенная под каждым из пиков на кривой, отвечает концентрации белка, образовавшего данную границу. [c.93] Свенссопом [75]. Усовершенствование заключается в применении наклонной щели и цилиндрической линзы (фиг. 18). Раствор в вертикальной О-образной кювете освещается горизонтальным пучком светау вырезанным горизонтальной щелью 1, которую можно рассматривать как источник света. Пучок света проходит через раствор и затем через наклонную щель 2 второго экрана. Если в растворе, находящемся в кювете, нет никакой границы, то горизонтальный пучок света не отклонится и на матовом экране возникнет вертикальное изображение кюветы. Узкий участок плоского пучка света пройдет через наклонную щель, и на матовом экране 4 появится светлая вертикальная полоса а Ь. Если же в и-образной кювете имеется граница, пучок света, прошедший через нее, отклонится вниз, так что участок отклоненного пучка света, который пройдет через щель 2, окажется смещенным вправо. Цилиндрическая линза 3, ось которой расположена вертикально, фокусирует свет лишь по горизонтали, но не по вертикали, в связи с чем изображение отклоненного пучка света появится на экране 4 в виде бокового выступа б. [c.94] При помощи электрофоретического исследования было обнаружено, что сывороточный глобулин, который рассматривался как однородный белок, является смесью, по меньшей мере, трех глобулинов, названных а-, р- и Y-глoбyлинaми [76]. Таким же путем было установлено, что кристаллический р-лактоглобулин [77, 78], кристаллический сывороточный альбумин [79] и кристаллический яичный альбумин [80, 81] являются смесями более чем двух белковых компонентов, которые могут быть разделены электрофоретически в их изоэлектрической точке или при других значениях pH [82]. [c.95] Электрофорез используется как для аналитического разделения белков, так и для препаративного выделения чистых белковых фракций так как и-образная кювета, применяемая для электрофоретического анализа, оказалась слишком мала для последней задачи, то для препаративных целей она была соответствующим образом видоизменена [83, 84]. [c.95] Поскольку характер электрофоретических диаграмм зависит от показателя преломления растворов, результаты электрофореза сильно зависят от всех факторов, которые могут повлиять на преломление. В белковом растворе преломление обусловлено в основном концентрацией белка, но в некоторой степени оно зависит и от ионов буфера. [c.96] Исходя из электрофоретических данных, пытались рассчитать действительный заряд белковой молекулы. Так как размеры и форма белковой молекулы точно неизвестны, можно было надеяться получить лишь приближенные результаты. Оказалось, однако, что найденные таким путем цифры удивительно хорошо совпали с числом зарядов, рассчитанным из кривых электрометрического титрования [45, 90] (см. табл. 8). [c.97] Вернуться к основной статье