ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Структура активной поверхности холинэстераз и механизм их каталитического действия при гидролизе эфиров БЕРГМАН Источники ферментов из "Катализ новые физические методы исследования 1960" Ферментативный гидролиз эфиров — обычная и широко распространенная биохимическая реакция. Поскольку для изучения кинетики гидролитических реакций можно пользоваться простой методикой, в последние годы делались неоднократные попытки объяснить химическим путем этот вид катализа, т. е., используя аналогии с известными неферментативными реакциями, определить компоненты активных центров. Основной задачей настоящего исследования является синтез искусственного фермента с той же избирательностью действия по отношению к субстрату, что и у природного катализатора, и скоростями реакции, сравнимыми со скоростями, наблюдаемыми в случае последнего. [c.291] Особый интерес представляет группа холинэстераз ( hE) не только с точки зрения их физиологической роли в проводящих тканях, но также и потому, что вследствие их специфичного поведения по отношению к субстратам и ингибиторам и их высокой эффективности по отношению к катионным субстратам возможны точные кинетические измерения. Несмотря на большое число экспериментальных работ, точная структура активной поверхности холинэстераз еще не установлена (см. обзор Уиттекера [1]). Ниже рассматриваются полученные результаты и обсуждается ряд не выясненных до настоящего времени вопросов. [c.291] Вследствие высокой скорости гидролиза под действием холинэстераз обычно можно работать с гомогенатами тканей, целыми клетками или с частично очищенными ферментами. В настоящее время известны методы получения лишь немногих холинэстераз в виде кристаллов высокой степени чистоты. [c.291] Метод допускает 250—400-кратную очистку. [c.291] Электрические органы различных рыб представляют собой исключительно богатый источник истинной холинэстеразы, и нз них могут быть получены методом Ротенберга и Нахмансона [3] очень чистые препараты фермента. Из конечных растворов, которые устойчивы в течение продолжительного времени, изолируют путем лиофилизации твердый продукт, который гидролизует 20—25 г ацетилхолина в час на 1 мг белка. [c.292] Эта холинэстераза высокой степени чистоты получена Эд-селлом [4] в работе по фракционировке плазмы. Псевдоэсте-раза, содержащаяся во фракции IV-6-3, была выделена в кристаллической форме. Холинэстеразы эритроцитов и плазмы имеются в продаже. [c.292] Разработано много методов для измерения активности холинэстераз. Некоторые из них могут быть применимы непосредственно при изучении гомогенатов тканей или крови, для других требуются препараты фермента высокой степени чистоты. [c.292] Двуокись углерода, выделяющаяся из буферного бикарбо-натного раствора при образовании свободной кислоты во время гидролиза эфира, измеряется по манометрическому методу Варбурга [5]. [c.292] Кислоту, образующуюся во время гидролиза, непрерывно нейтрализуют концентрированной щелочью, используя любой индикатор или, что более удобно, применяя метод электрометрического титрования [6, 7]. [c.292] Так как холинэстеразы гидролизуют эфиры тиохолина, то сульфгидрильная группа последнего, освобождающаяся при реакции, может быть измерена йодометрически [10, И]. [c.293] Этот же тип субстрата используется в ультрафиолетовой спектрофотометрии, так как ацетилтиохолины обладают максимумом при 226 ц,. Практически более удобно проследить изменение оптической плотности примерно до 250 )и, [12]. Этим методом, который обязательно требует применения очищенных ферментов, измеряют концентрации субстрата порядка 5-10 М. [c.293] Количественное измерение свободного тиохолина — одного из продуктов гидролиза ацетилтиохолинов — осуществляется с помощью другого аналитического метода, а именно путем использования индикаторов окислительно-восстановительных реакций (например, дихлорфенола, индофенола [Ю]). Метод, который до сих пор использовался только для полуколичественных измерений, может быть легко усовершенствован и позволит определять концентрации порядка 10 — 10 М. [c.293] Это свойство служит для отличия холинэстераз от других так называемых неспецифичных эстераз, которые с трудом действуют на такие субстраты. Каталитическое действие холинэстераз, однако, не ограничивается гидролизом эфиров. Так, эти ферменты катализируют также и обратную реакцию, например этерификацию кислот холином [14]. Они способствуют пе-реэтерификации [15] и конденсации гидроксиламина с кислотами [14] или эфирами [15]. Ангидриды карбоновых кислот также служат субстратом для холинэстераз [16, 17] и могут претерпевать все реакции, описанные для эфиров, т. е. гидролиз, этерификацию и оксимирование. [c.294] ЯВЛЯЮТСЯ функцией р5 = —lg концентрации субстрата и обнаруживают коренное различие между ферментами обоих типов. Для истинного типа холинэстеразы кривая зависимости активности от р5 имеет колоколообразную форму, что указывает на автоингибирование при высоких концентрациях субстрата [18]. В случае псевдофермента эта зависимость изображается 5-об-разной кривой в результате того, что максимальная скорость не только достигается при оптимальной концентрации субстрата, но и сохраняется столь же высокой при больших концентрациях. [c.295] Здесь нужно подчеркнуть, что это различие систематически проявляется только по отношению к холиновым эфирам. Для других субстратов оба типа холинэстераз могут обнаружить ту или другую форму кривой зависимости активности от р5. [c.295] В противоположность эфирам карбоновых кислот на эфиры фосфорной кислоты с алифатическими спиртами ферменты не действуют. Однако холинэстеразы реагируют с фосфорными ангидридами гомогенного (Р-О-Р) или гетерогенного типа (Р-Х), а также с некоторыми феноловыми эфирами [19]. Энергия активации гидролиза эфиров значительно выше, чем энергия активации гидролиза ангидридов. Это может объяснить, почему холинэстеразы не способны расщеплять нейтральные эфиры фосфорной кислоты, но воздействуют на эфиры с некоторыми фенолами. Органические сульфаты, например метан-сульфонилфторид, ведут себя аналогично фосфатам [20]. [c.295] В то время как большинство производных карбоновых кислот после ферментативного гидролиза удаляется с активной поверхности и создается возможность воздействия на новую молекулу субстрата, реакционноспособные производные фосфорной кислоты ведут себя иначе. Здесь после начальной стадии гидролиза (см. V, 2) часть молекулы прикрепляется к ферменту, образуя такую форму, которая не может быть легко расщеплена и вызывает, таким образом, необратимое ингибирование. [c.295] Небольшие структурные изменения в пределах эфирной группы или в ее непосредственной близости могут оказывать резко выраженное влияние на способность соединения служить в качестве субстрата для холинэстераз. [c.295] Вернуться к основной статье