ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Методика хроматографирования из "Исследование жирных кислот и липидов методами хроматографии" Как уже указывалось выше, для наиболее полной идентификации рекомендуется предварительное фракционирование природной смеси жирных числот. Одним из способов отделения насыщенных жирных кислот от ненасыщенных является окисление последних. Это можно выполнять как предварительно, так и во время хроматографирования на бумаге. [c.9] Необходимое оборудование. 1. Термостат с терморегулятором. [c.10] При работе методом круговой хроматографии камерой могут служить половинки чашек Петри или стеклянные кристаллизаторы. При отсутствии крышек их можно вырезать из стекла и притереть. [c.10] Трубочки-бусы служат для отделения одной хроматограммы от другой. [c.11] Наилучшей разделяющей способностью обладает бумага, пропитанная восходящим способом растворами вазелинового масла соответствующей концентрации (см. стр. 13). [c.12] Техника пропитывания гидрофобным растворителем. Полосы бумаги нанизывают на стеклянные палочки, отделяя каждую полосу стеклянными бусами, и опускают в кювету с раствором, предназначенным для гидрофобизации бумаги, до линии погружения. После полного пропитывания восходящим способом их просушивают на воздухе. Количество вещества, израсходованного на пропитывание бумаги, определяют по разности в весе полос бумаги до и после пропитывания (после удаления растворителя). Для получения воспроизводимых результатов сохраняют одно и то же направление как при пропитывании бумаги, так и в процессе разделения кислот. [c.12] При использовании в качестве неподвижной гидрофобной фазы смеси углеводородов или их растворов бумагу пропитывают или опрыскиванием, или погружением на 1—3 минуты. [c.12] С целью пропитывания дисков для круговой хроматографии гидрофобный растворитель помещают в чашку Петри (или кристаллизатор), где установлен треугольник из спаянных стеклянных трубок, на который кладут хроматограмму. В отверстие круга вставляют фитиль, скрученный из небольшой полосы фильтровальной бумаги, с помощью которого идет пропитывание. После пропитывания хроматограмму высушивают на воздухе. Пропитывание дисков углеводородной фракцией керосина проводят погружением их на одну минуту, затем диски отжимают роликом между двумя листами фильтровальной бумаги и просушивают в висячем положении в течение часа прн комнатной температуре [190]. [c.12] Методы нанесения кислот на бумагу. На стартовую линию каждой полосы бумаги наносят жирные кислоты, растворенные в метаноле, смеси спирта с эфиром (1 1) или хлороформе, в количестве 5—30 мкг каждой кислоты в общем объеме 5—10 мкл. Предпочтительно растворение в первых двух растворителях, так как хлороформ растворяет неподвижную фазу. Если жирные кислоты плохо растворимы в указанных растворителях, последние подогревают. Обычно метчики (стандартные растворы кислот) наносят на одну крайнюю и на одну среднюю полосу, если пользуются сложной формой полос бумаги. При работе способом круговой хроматографии [190] из бумаги вырезают диски диаметром 10—20 см. Последние делят на секторы, отделяя один от другого щелью шириной 1 мм, а в центре круга делают отверстие для фитиля. В каждый сектор на расстоянии 1 см от центра круга наносят раствор кислот, в отверстие круга вставляют новый фитиль и проводят хроматографирование. Поступление растворителя на бумажный диск возможно и по бумажному язычку, имеющему ширину 7—8 мм. [c.12] Реактивы I. Смеси веществ, используемые в качестве подвижной фазы. 1. Смесь 98% уксусной кислоты, 85% муравьиной и воды (30 10 1) [1, 4, 6, 8, 9, 43, 65, 111, 157]. [c.13] Наиболее чувствительным из всех перечисленных является реактив 1, впервые предложенный Е. К. Алимовой и Г. Д. Болговой [4], получивший такую же оценку в работе ЗИрзк с соавторами [217]. Этим реактивом при соответствующих условиях выявляют 0,5 мкг пальмитиновой кислоты. [c.13] Неподвижная фаза — вазелиновое масло или ее смесь с парафином подвижная — смесь уксусной, муравьиной кислот и воды. [c.14] После нанесения растворов жирных кислот хроматограммы нанизывают через верхние и нижние отверстия на стеклянные палочки, разделяя одну хроматограмму от другой трубочками-бусами, и помещают в хроматографический сосуд с небольшим слоем подвижного растворителя. Верхнюю стеклянную палочку укрепляют между противоположными стенками сосуда резиновыми пробками так, чтобы нижние концы хроматограмм не прикасались к слою подвижного растворителя. На внутренние стенки сосуда навешивают две полосы фильтровальной бумаги, нижние края которых погружают в подвижный растворитель для обеспечения насыщения камеры. Сосуд закрывают стеклянной крышкой, имеющей деревянную раму с отверстием, закрывающимся пробкой места соприкосновения крышки со свободными краями сосуда оклеивают лейкопластырем и сосуд помещают в термостат при соответствующей температуре для полного насыщения камеры. В этот же термостат в отдельной склянке помещают необходимое дополнительное количество подвижного растворителя. Примерно через час через воронку с длинным тубусом, вставленную в отверстие рамы крышки, заливают подвижный растворитель до линии погружения. При использовании хроматограмм размером 34Х(8 2) см обычно при 23—25° разделение идет 18—20 часов, при 86° — 9—10 часов. Фронт растворителя можно обнаружить наложением метилоранжа вдоль кромок хроматограммы [217] определению фронта помогает установка яркого света за хроматографическим сосудом. [c.14] При хроматографировании жирных кислот в нисходящем потоке придерживаются тех же условий, которые применяют при восходящем способе работы, за исключением использования приспособлений для закрепления сосудов с подвижным растворителем и самих хроматограмм (пояснения см. в разделе Необходимое оборудование ). [c.14] Таким образом, на основании изложенного материала можно считать, что разделение ненасыщенных кислот лучше выполнять при температуре 22—25°, разделение Сго—Сгв-насыщенных кислот — при 35—37°, а Сге—Сзе-насыщенных кислот — при 86°. Насыщенные жирные кислоты, у которых количество атомов углерода меньше 20, разделяют при комнатной температуре. [c.16] Для разделения насыщенных и ненасыщенных высших жирных кислот от i8 до Сзб бумагу лучше пропитывать смесью парафина с вазелиновым маслом. Ненасыщенные жирные кислоты с количеством углеродных атомов меньше 20 лучше разделять на бумаге, пропитанной 10% раствором вазелинового масла в бензоле, а для разделения насыщенных кислот до ao можно использовать бумагу, пропитанную как вазелиновым маслом, так и смесью последней с парафином. [c.16] Обнаружение жирных кислот на бумаге. Для обнаружения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот хроматограммы просушивают на воздухе до полного удаления подвижного растворителя, промывают один раз дистиллированной водой и жирные кислоты переводят в нерастворимые в воде соли. Для этого хроматогра.ммы на 20 минут заливают одним из предлагаемых для этой цели растворов, лучше при температуре 30°. Если в смеси содержатся высшие жирные кислоты порядка 24—Сзб, то переведение их в соли лучше проводить при 80° в течение 20 минут при покачивании ванночки. Затем раствор сливают и хроматограмму промывают 4—5 раз дистиллированной водой. Соли жирных кислот выявляют одним из указанных ниже способов. [c.16] Для выявления висмутовых, свинцовых, медных и серебряных солей жирных кислот в виде сернистых производных хроматограммы раскладывают в стеклянных ванночках и заливают раствором сернистого натрия, односернистого аммония или разбавленным раствором сульфгидрата аммония. Как только интенсивность окраски пятен достигает максимума, хроматограммы 2—3 раза промывают дистиллированной водой для удаления избытка реактива. [c.16] При обнаружении серебряных солей жирных кислот дитизоном высушенные на воздухе хроматограммы заливают на 10—15 минут раствором дитизона в четыреххлористом углероде до появления малиновокрасных пятен. Раствор сливают и один раз промывают четыреххлористым углеродом. [c.16] Для обнаружения медных солей жирных кислот высушенные на воздухе хроматограммы погружают в раствор дитиооксамида до четкого появления темно-зеленых пятен медных солей жирных кислот. Избыток дитиооксамида удаляют промыванием (2 минуты) этиловым алкоголем. Менее чувствительным реактивом на медные соли жирных кислот является ферроцианид калия. Для обнаружения медных солей этим способом хроматограммы помешают в данный раствор на 30 минут, затем промывают проточной водой и высушивают. [c.17] Вернуться к основной статье