ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Ингибирование и активация избытком субстрата из "Кинетические методы в биохимическихисследованиях" Если величины констант Кт и КЫ соизмеримы, использование указанных прибл1ижений приводит к большим ошибкам. В этом случае целесообразно иапользовать разностный мето(д, развитый Полтораком и сотрудниками (Полторак, Пряхин, Чухрай, 1976). Суш ность метода заключается в следуюш,ем. [c.24] Из зависимости Ау/Ах от Х1- Хт) можно найти параметры а и й. [c.24] График зависимости (1.64) представлен на рис. 7,6. На основе этих данных определяются величины Ут и К. [c.25] Разностные методы — достаточно удобный инструмент при анализе многопараметричеоких уравнений. При определении параметров многократно используются экспериментальные точки. Однако применять разностные методы следует с известной осторожностью, например, они не пригодны для экспериментальных данных, полученных с большой случайной погрешностью. В этом случае разностные функции дают значительный разброс точек, что приводит к высокой неопределенности в искомых параметрах. Кроме того, при построении разностных функций необходимо использовать достаточно большие значения Ау и Ах так, чтобы они существенно превосходили случайную ошибку эксперимента. При этом целесообразно для вычисления разностей использовать значения функций на различных ( восходящих и нисходящих ) участках экспериментальной зависимости. [c.25] При низких концентрациях субстрата В К2 скорость представляет собой квадратичную функцию концентрации субстрата. [c.29] Для экспериментальных даиных, приведенных на рис. 9, степень функциональной зависимости близка к двум, т. е. в этой реакции происходит взаимодействие на одной молекуле белка по крайней мере двух молекул субстрата. [c.30] То же самое уравнение имеет место, если Ь очень велико. [c.31] Кинетическая теория аллостерических взаимодействий за последние годы яолучила большое развитие. Помимо эффектов взаимодействия центров на одной молекуле белка сигмоидальная кинетика может наблюдаться и для диссоциирующих ферментных систем (Курганов, 1978). Читатель может ознакомиться с современным состоянием исследования аллостерических эффектов, прочитав монографию Б. И. Курганова. [c.32] Большинство экспериментальных кинетических исследований ферментов выполнено в режиме стационарной кинетики в условиях, когда скорость изменения концентраций лабильных интермедиатов существенно ниже скоростей образования продуктов или расхода субстратов. Как правило, постановка экоперимен 1ч)в в стационарном кинетическом режиме не вызывает сложностей. При этом из данных стационарной кинетики получают принципиально важную информацию о скоростях лимитирующих стадий ферментативных реакций. Максимальная скорость ферментативной реакции характеризует самый медленный кинетический процесс (или группу самых медленных процессов), протекающий в активном центре катализатора. Действительно, яз рассмотренной выше кинетической схемы реакции с участием произвольного числа п лабильных интермедиатов следует, что если существует какая-либо реакция, характеризуемая наименьшим значением константы скорости (см. схему (1.20) и уравнение (1.23)), то эта константа будет определять величину максимальной скорости реакции. Если / = 2,. .., п, /=7 1, то кат = - Поскольку лимитирующие процессы представляют наибольший интерес, информацию, получаемую методами стационарной кинетики, трудно переоценить. [c.33] С другой стороны, существуют достаточно большие сложности в интерпретации стационарно-кинетических данных. Идентификация лимитирующих стадий реакции — одна из наиболее сложных задач в исследовании механизмов действия ферментов. [c.33] Рассмотрим несколько подходов для определения лимитирующей стадии реакции. [c.33] Нестационарная кинетика. Последний подход является общим для идентификации механизма реакции и определения лимитирующей стадии процесса. Его особенности рассмотрены ниже. [c.34] Интересно проанализировать численные значения каталитических констант скоростей и констант Михаэлиса различных ферментов с тем, чтобы представить средние скорости реакций в биохиминеских системах. [c.34] На рис. 10 приведены плотности распределения ферментов по величине кат, Кт и Ki tlKm. Кривые, представленные на этом рисунке, отражают вероятность того, что каждый случайно выбранный фермент будет характеризоваться заданным значением параметра. Так, вероятность того, что какой-либо неизвестный фермент имеет значение кат 10 с- , весьма высока 0,5. Путем интегрирования плотности распределения могут быть вычислены вероятности того, что выбранный наугад фермент-будет обладать кинетическими характеристиками в заданном диапазоне. [c.35] Из рис. 10 видно, что наиболее распространены ферменты, лимитирующие стадии реакций в которых имеют порядок 10 с , Km Q М. Ферменты весьма унифицированы по каталитическим характеристикам. Энергетический барьер 8—15 ккал/моль, проявляющийся на лимитирующих стадиях ферментативных реакций и приводящий к числу оборотов активных центров 10 с обусловлен, по-видимому, рядом физико-химических эффектов. [c.35] Детальное исследование стационарной кинетики ферментативной реакции может дать важную информацию о механизме действия фермента. Рассмотрим особенности и логику исследования механизма реакций в стационарном режиме на примере изучения гидрогеназы — фермента, образующего и активирующего молекулярный водород. [c.36] Вернуться к основной статье