ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Вывод уравнений ферментативной кинетики на основе простых моделей из "Ферментативный катализ" Каждому формальному механизму реакции соответствует определенное кинетическое поведение системы. Вывод кинетических уравнении, количественно описывающих это поведение, позволяет сопоставить постулированный механизм исследуемой реакции с экспериментальными данными. [c.41] Вывод уравнений химической кинетики состоит обычно из трех этапов. [c.41] Выписываются уравнения, выражающие взаимозависимость изменений концентраций всех реагирующих веществ, промежуточных и конечных продуктов реакции и устанавливающие все формы, в которых указанные вещества присутствуют в постулируемом механизме. Иными словами, механизм реакции выража[ется с помощью математических символов. [c.41] Одно (или несколько) из этих уравнений содержит суммарную скорость реакции. Это дифференциальное уравнение преобразуется в уравнение, выражающее суммарную скорость через концентрации тех веществ, которые могут быть экспериментально измерены. [c.42] Полученное уравнение интегрируют и получают выражение для зависимости концентрации реагирующих веществ и продуктов реакции от времени. [c.42] Такой способ вывода уравнения предпочтителен потому, что первичные экспериментальные данные, получаемые для реальной системы, с которой сравнивается постулируемая модель, выражаются через указанные здесь параметры. Следует напомнить, однако, что при исследовании кинетики ферментов ингибирование продуктами реакции и нестабильность ферментов вынуждают пользоваться непосредственно дифференциальным уравнением и определять начальные скорости реакции при различных концентрациях субстрата. По этой причине третий этап вывода уравнения — интегрирование— производится не всегда. [c.42] В обоих случаях являются зеркальным отражением одна другой. Различие состоит в том, что (ЕА) достигает разных максимумов и, кроме того, в случае II появляется заметный лаг-период в росте концентрации продукта. В обоих случаях сразу после смешения Е и А образуется некоторое количество комплекса (ЕА), нб в случае I этот комплекс не может накапливаться в значительном количестве и ход образования X отражает убыль А. [c.45] Обозначения те же. что н на фиг. 4. [c.45] В случае же II накапливается некоторое количество (ЕА) в системе, зависящее от соотношения констант скорости реакций 1 и 2 при этом в течение некоторого промежутка времени, называемого переходной стадией, скорость образования продукта X замедлена. [c.45] Вывод был бы завершен, если бы удалось решить уравнение (11) и получить выражение для ЕА), в которые входили бы только Ло, Ео и константы скоростей. К сожалению, строго это сделать невозможно, и чтобы достигнуть цели, приходится ввести некоторые упрощения. [c.47] Мы не будем рассматривать здесь решения уравнений на осн.ове упрощений Анри — Михаэлиса — Ментен и Ван-Слайка — Каллена. В настоящее время нз1 опи-лось много данных, свидетельствующих о том, что эти упрощения не с тветствуют экспериментальным данным. Относительные значения индивидуальных констант скоростей в ферментативных реакциях различаются не столь сильно. Как следует из фиг. 5 и из высказанных выше соображений, предположение о стационарности процесса служит более надежной базой развития ферментативной кинетики .. [c.48] Как можно проверить применимость уравнения (16), выведенного на основе концепции стационарности, к анализу конкретных ферментативных реакций Это было сделано много раз как до, так и после вывода самого уравнения. Оно идентично уравнению (5) Анри, приведенному в предыдущем разделе этой главы. [c.49] Графическое представление и оценку кинетических коэффициентов с доверительными границами лучше всего осуществлять с помощью статистических методов, но прямое использование метода наименьших квадратов для одной из форм преобразованного уравнения в этом случае не годится, так как при обращении происходит искажение ошибок [22, 23]. Обрабатывать данные таким образом можно лишь при условии подходящего взвешивания ошибок, а лучше всего пользоваться методами итеративного приближения с помощью равнобочной гиперболы. Клеланд [24] рассмотрел необходимые для этого условия и разработал программы для вычислительных машин, предусматривающие все наиболее часто встречающиеся случаи. [c.51] Следует особо подчеркнуть, что совпадение уравнений (5) и (16) не указывает на то, что механизм действия. ферментов соответствует тому механизму, для которого выведено уравнение (16). С этой точки зрения поучительно заметить, что уравнение точно того же вида может быть получено для механизмов, подчиняющихся ограничениям, которые постулировали Анри и Михаэлис и Ментен или Ван-Слайк и Каллен. Отличие будет состоять лишь в том, что смысл констант будет иным при этом очевидно, что константы, выведенные для стационарного механизма (например, Кт= k- + k+2) k+ ), могут найти наиболее широкое применение. Совпадение уравнений (5) и (16) действительно указывает лишь на одно — что принятый нами механизм, быть может, верно описывает ферментативный катализ. Для того чтобы подтвердить большую достоверность данного механизма по сравнению с другими, необходимо найти какие-то иные методы анализа. [c.51] Уонг [11] недавно также рассмотрел вопросы, связанные с математическим описанием кинетики ферментативных реакций, обратив особое внимание на гипотезу стационарности. Он отмечает, что существенным условием применимости гипотезы стационарности является быстрое образование фермент-субстратного комплекса — условие, которое, несомненно, выполняется при достаточно большом избытке субстрата по отношению к ферменту. Практический вывод, к которому он приходит (распространяя его и на двухсубстратные реакции), состоит в том, что принцип стационарности может быть использован в условиях, обеспечивающих линейную зависимость U0 от Ео. [c.53] Для современных энзимологов существование фермент-субстратных комплексов — почти аксиома. В настоящее время накопилось огромное множество кинетических и других данных, подтверждающих образование таких комплексов в ходе ферментативных реакций, причем многие из них очень трудно объяснить каким-либо иным образом. Наиболее убедительны с этой точки зрения многочисленные прямые наблюдения образования соединений фермента с субстратом. Первое из них — наблюдение осаждения папаина его субстратом фибрином [1] — относится к 1880 году последние известные нам работы такого рода — исследования кристаллического фермент-субстратного комплекса оксидазы О-ами-нокислот с помощью оптических методов и метода ЭПР [2—5]. Классическими примерами служат гемопротеиды— пероксидаза и каталаза [6, 7], для которых образование промежуточных комплексов было доказано с помощью прямых спектроскопических методов более 30 лет назад [8, 9]. Позднее прямые доказательства образования подобных комплексов были получены с помощью самых разнообразных методов при исследовании гидролитических ферментов [10—14], альдолаз [15, 16], ряда дегидрогеназ [17—21] и тиотрансферазы ро-данезы [22, 23]. [c.55] Важную роль в образовании комплекса играет диффузионное сближение фермента и субстрата, определяющее частоту соударений реагирующих частиц. Доля продукти] ных соударений, ведущих к взаимодействию, зависит от ориентации сталкивающихся молекул и других факторов, которые будут рассмотрены ниже. Весьма вероятно, что при взаимодействии образуются несколько изомерных фермент-субстратных комплексов. [c.56] Имеется ряд данных, позволяющих предполагать, что более глубокий анализ проблемы выявит весьма сложное строение этих кинетически, постулируе мых комплексов и покажет, что каждому из них соответствует набор (или сомножество) электронных состояний и, возможно, даже несколько химически различимых форм. Эти уточнения, однако, нисколько не обесценивают представле-)ние о комплексах как таковое и основанные на нем кинетические выводы. [c.56] Ниже будут рассмотрены типы связей, которые могут участвовать в образовании фермент-субстратных комплексов, и приведены некоторые прямые доказательства существования простых аддитивных фермент-субстратных комплексов. [c.56] ДОЛЖНО происходить за счет тех же множестьенных сил, которые ответственны за стабилизацию третичной и четвертичной структуры белков. И лишь для субстратов значительно меньшего молекулярного веса могут оказаться успешными попытки оценить индивидуальные силы связывания в чистом виде . Связывание белками различных небольших молекул, например неорганических ионов и некоторых ароматических структур, изучалось совершенно независимо от развития проблем ферментативного катализа. Но при этом были получены результаты, имеющие важнейшее значение для понимания механизма образования фермент-субстратных комплексов. [c.57] Вернуться к основной статье